微生物染色技术培训课件

微生物染色技术细菌的大小测量细菌大小的单位是微米（μm）多数球菌直径为：1μm中等大小杆菌长约为２－３μm.同一种细菌可因菌龄不同和环境等因素而有差异细菌的大小与形态2微生物染色技术细菌的形态细菌的基本形态有三种：球菌(coccus)；杆菌(bacillus)螺形菌(spiralbacterium)3微生物染色技术细菌结构模式图4微生物染色技术细菌的结构分为两类：荚膜鞭毛菌毛芽孢细胞壁细胞膜细胞质核质细菌的基本结构细菌的特殊结构5微生物染色技术习惯上：细菌的结构基本结构特殊构造细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质、核糖体和内含物等细菌基本生命活动中所必需各种细菌都具有的结构

如夹膜、鞭毛、菌毛、芽孢等与基本生命活动没有多大关系并不是所有细菌都有这些结构6微生物染色技术细胞质间体菌毛荚膜细胞膜鞭毛内含颗粒核糖体核体细胞壁/外膜（如果存在）7微生物染色技术细胞壁细胞质细胞膜细菌的染色体菌毛核糖体质粒鞭毛内含物荚膜8微生物染色技术一、基本构造（一）细胞壁(Cellwall)位于细菌细胞最外层，贴近细胞膜之外，是一层坚韧而具有一定弹性的膜状结构。

结构比较复杂较厚（10~80nm)质量均匀网状结构可承受细胞内强大的渗透压而不破坏9微生物染色技术革兰氏染色法

由于各种细胞壁所含成分不一样，1884年丹麦科学家（ChristionGram）发明了一种染色方法，我们称之为革兰氏染色法。据革兰氏染色反应不同，可以把细菌分为两大类：

-革兰氏阳性菌

G+

-革兰氏阴性菌

G-10微生物染色技术革兰氏染色(Gramstaining)过程1）初染：结晶紫溶液染色1~3min,水洗2）媒染：卢戈碘液1min，水洗3）脱色：95%的酒精，脱色时间根据抹片的厚度灵活掌握，多在15~30s之间，水洗4）复染：番红染色液染1min，水洗5）干燥：吸干或自然干燥6）镜检：G+菌呈蓝紫色，G-菌为红色11微生物染色技术碘液媒染95%乙醇脱色石炭酸复红或番红染色液复染细菌菌体涂片固定结晶紫染色GramPositiveG+GramNegativeG-12微生物染色技术GramstainofGram+Staphylococcuscells

13微生物染色技术GramstainofGram-E.colicells14微生物染色技术革兰氏阳性菌细胞壁组分：

肽聚糖、磷壁酸革兰氏阴性菌细胞壁组分主要有：

肽聚糖、外膜（脂蛋白脂质双层脂多糖）细菌的细胞壁特殊成分基本成分—肽聚糖革兰阳性菌—磷壁酸革兰阴性菌—外膜15微生物染色技术肽聚糖化学组成：特点：层次多（50层）三维空间网格结构特点：层次少（2层）二维平面结构G（+）菌G（-）菌聚糖骨架聚糖骨架四肽侧链（丙、谷、赖、丙）四肽侧链（丙、谷、二氨基庚二酸、丙）五肽交联桥16微生物染色技术

（２）主要成份：肽聚糖(peptidoglycan)又称mucopetide

Gram’s阳性菌：肽聚糖＋磷壁酸＋特殊蛋白肽聚糖:聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥G+菌含量丰富，15-50层占胞壁干重50~80%

幻灯片3317微生物染色技术Ａ、聚糖骨架:N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid)两者由β

-1,4糖苷键联结,各种细菌的聚糖支架相同，这是肽聚糖合成的第一步。18微生物染色技术

Ｂ、四肽侧链：氨基酸组成及联结方式随菌种不同而异，以金葡菌为例，N－乙酰胞壁酸上连结L－丙氨酸、D－谷氨酸（或D－异谷氨酰胺）、L－

赖氨酸、D－丙氨酸，这是肽聚糖合成的第二步。

19微生物染色技术Ｃ、五肽交联桥：五个甘氨酸组成的交联桥，一端接在第三位L-赖氨酸上，另一端在相邻四肽侧链的未端D-丙氨酸上，这是肽聚糖合成的第三步。

20微生物染色技术1、革兰氏阳性菌细胞壁的结构壁磷壁酸

肽聚糖脂磷壁酸

阳性菌特有细胞壁较厚，约15~80mm。其化学成分主要是肽聚糖，约占细胞壁干重的40~95%，形成15~50层聚合体。组成肽聚糖的聚糖骨架与革兰氏阴性细菌相同，但四肽侧链的组成和交联方式则与革兰氏阴性细菌不同。磷壁酸(Teichoicacid)21微生物染色技术（1）肽聚糖（peptidoglycan）又称“粘肽”(Mucopetide)、“糖肽聚”(glycopetide)或胞壁质（murein），是细菌细胞壁特有物质。细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在。合成肽聚糖是原核生物特有的能力。22微生物染色技术凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都能损伤细胞壁而使细菌变形或杀伤细菌，如：溶菌酶能水解肽聚糖支架的β-1，4糖苷键，引起细菌裂解。青霉素和头孢霉素能抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合成完整的细胞壁，可导致细菌死亡。23微生物染色技术

不同的抗生素作用于肽聚糖合成的不同阶段：

抑制第一步：磷霉素、环丝氨酸、溶菌酶

抑制第二步：万古霉素、杆菌肽 抑制第三步：青霉素、头孢菌

人类没有细胞壁，因此研究和发掘破坏或阻抑肽聚糖合成的新型抗菌药物是我们的方向之一24微生物染色技术革兰氏阳性菌“肽聚糖”

（如金黄色葡萄球菌）由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥组成青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，G）N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramicacid，M）25微生物染色技术磷壁酸

膜磷壁酸(Membraneteichoicacid)与细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸连结又称脂磷壁酸(Lipteichoicacid)，和细胞膜连结，另一端均游离于细胞壁外。壁磷壁酸(Wallteichoicacid)（2）磷壁酸（Teichoicacid）G+菌特有，是由核糖醇(Ribitol)或甘油(Glyocerol)残基经磷酸二酯键相互连接而成的多聚物，并带有一些氨基酸或糖。约30个或更多磷壁酸分子组成的长链，穿插于肽聚糖中。26微生物染色技术壁磷壁酸(含量多，通过共价键与肽聚糖分子结合,并延伸到肽聚糖分子表面)

膜磷壁酸(与细菌细胞膜的脂类结合)磷壁酸（Teichoicacid）27微生物染色技术磷壁酸的作用抗原性很强——G＋菌的表面抗原；在调节离子通过肽聚糖层中起作用；与细胞膜上一些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，对宿主具有粘附作用，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。因带负电荷，故可与环境中的Mg＋等阳离子结合，提高这些离子的浓度，以保证细胞膜上一些合成酶维持高活性的需要。28微生物染色技术2、革兰氏阴性菌细胞壁结构较薄，约10～15nm，结构成分较为复杂，由肽聚糖和外膜组成，外膜由脂蛋白、脂质双层、脂多糖组成。外膜：G－菌特有，为胞壁主要成分，厚8-10nm。包括：脂蛋白：向内与肽聚糖（ＤＡＰ）相连脂质双层：液态，似细胞膜

脂多糖：G－菌的内毒素，由类脂A、核心多糖、特异性多糖组成29微生物染色技术（1）革兰氏阴性菌“肽聚糖”（大肠杆菌）包括聚糖骨架、四肽侧链四肽侧链的第三位氨基酸由二氨基庚二酸（DAP）替代，以肽健直接与相邻四肽侧链中的D-丙氨酸相连，无五肽交联桥，形成二维结构，故其结构较疏松30微生物染色技术GGGGMM丙谷DAB丙丙DAB谷丙31微生物染色技术N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸聚糖骨架四肽侧链L-丙氨酸D-谷氨酸二氨基庚二酸D-丙氨酸L-丙氨酸D-谷氨酸二氨基庚二酸D-丙氨酸32微生物染色技术外膜①脂蛋白：位于肽聚糖层和脂质双层之间，起连接作用，使外膜和肽聚糖构成一个整体。②脂质双层：磷脂双层，内嵌外膜蛋白（outmembraneproteinOMP），具有不同的功能。如有的外膜蛋白为孔蛋白是小分子的通道；有的是噬菌体、性菌毛、细菌素的受体。33微生物染色技术③脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)---是革兰氏阴性菌的内毒素；有以下三部分组成：

类质A（LipidA）：类脂A：是细菌内毒素的毒性和生物学活性的主要组分，无种属特异性。是细菌内毒素的毒性和生物学活性的主要组分。

核心多糖(corepolysaccharide)：位于类脂A的外层，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）、磷酸乙醇胺等组成。有种属特异性。

特异性多糖(specificpolysaccharide)：由数个至数十个低聚糖重复单位组成的多糖链。具有种特异性。革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原）

34微生物染色技术脂多糖（LPS）

是革兰阴性菌外膜的组成成分，包括类脂A、核心多糖和O特异性多糖三部分，又称为内毒素。类脂A是内毒素的主要毒性成分；核心多糖具有属特异性，同一属细菌的核心多糖的抗原性相同；特异性多糖即菌体O抗原，具有种的特异性。概念35微生物染色技术是革兰氏阴性细菌致病物质－内毒素的物质基础与磷壁酸相似，也有吸附Mg+、Ca2+等阳离子以提高这些离子在细胞表面的浓度的用；由于LPS结构的变化，决定了革兰氏阴性细胞表面抗原决定簇的多样性；具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能。脂多糖功能36微生物染色技术3、细菌细胞壁结构比较特征革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌强度较坚韧较疏松肽聚糖组成肽聚糖、侧链、交联桥肽聚糖、侧链结构类型三维空间结构二维网状结构厚度与层次厚，20~80nm,可达50层薄，5~10nm,仅1~3层，含量多，占细胞壁干重的50~80%少，占细胞壁干重的5~20%交联方式侧链间以肽桥交联侧链间以肽键交联磷壁酸有无脂蛋白无有外膜无有脂多糖无有37微生物染色技术4、细胞壁的功能1）保持：细菌外形2）保护：免受外界渗透压和有害物用质的损害3）屏障：它具有相对通透性，对物质的进出，起着选择性分子筛的屏障作用。4）抗原性：带有多种抗原决定簇，决定细菌菌体的抗原性。5）与细菌某些染色反应和药物敏感性有关。38微生物染色技术（5）革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁结构差异的生物学意义

染色性：革兰阳性菌细胞壁结构致密，含脂类物质少，不易酒精脱色，革兰氏染色成蓝紫色（紫色）；反之革兰阴性菌染成红色；抗原性：革兰阳性菌的重要表面抗原之一是磷壁酸，革兰阴性菌的核心多糖和O抗原多糖是为重要表面抗原；毒性：革兰阴性菌的脂多糖即为内毒素（类脂A为内毒素主要成分），革兰阳性菌无此成分；药物敏感性：革兰氏阳性菌对青霉素，溶菌酶敏感，革兰阴性菌则否。39微生物染色技术G+菌与G-菌的差别及与细胞壁的关系革兰阳性菌革兰阴性菌细胞壁的关系染色性蓝紫色（紫色）红色细胞壁对酒精的通透性抗原性主要为磷壁酸主要为外膜细胞壁的化学组成不同毒性无内毒素有内毒素内毒素为阴性菌细胞壁成分脂多糖对青霉素的作用有效无效青霉素作用部位为肽聚糖五肽交联桥对溶菌酶的作用有效无效溶菌酶作用部位为肽聚糖聚糖骨架40微生物染色技术（二）细胞膜（Cellembrane）

细菌细胞膜的结构与真核细胞者基本相同，由蛋白质、脂类和少量的多糖组成。所含的脂类均为磷脂，不含胆固醇。磷脂由磷酸、甘油、脂肪酸和含氮的碱基构成。也称质膜(Cytoplasmicmembrane)。位于细胞壁内侧，包绕在细菌细胞质外的具有弹性的半渗透性脂质双层生物膜。41微生物染色技术细胞膜的功能：1）选择性通透作用，与细胞壁共同完成内外物质交换。2）膜上有多种呼吸酶，参与细胞的呼吸过程。3）膜上有多种合成酶，参与生物合成过程。4）传递信息，膜上的某些蛋白质能接受光、电及化学物质等的刺激信号并发生构象变化，从而引起细胞内的一系列代谢变化和产生相应的反应。5）细菌细胞膜可以形成特有的结构。42微生物染色技术（三）核体（nucleoid）（基因组DNA）细菌为原核细胞，遗传物质为双股环状DNA，处于细胞质中，相对集中于一个区域，无核膜，无核仁，也称为拟核或原核。核质由单一密闭环状双链DNA分子反复回旋卷曲盘绕组成松散网状结构核体具有细胞核功能，含有细菌的遗传基因，控制细菌的遗传与变异。43微生物染色技术44微生物染色技术45微生物染色技术（四）细胞质（Cytoplasm）细菌细胞膜内包裹的、除核体以外的所有物质，是一种无色、透明、均质的胶体，基本成分为水、蛋白质、脂类、多糖、核糖核酸及无机盐类等，是细菌进行营养物质代谢及合成核酸和蛋白质的场所。含有各种酶系统、核糖体、质粒、包含物等。46微生物染色技术1、质粒（Plasmid）1）质粒为染色体外的遗传物质，存在于细胞质中。为闭合环状的双链DNA，控制细菌某些特定的遗传特性。2）例如：耐药因子、细菌素及性菌毛基本均编码在质粒上。3）质粒能进行独立复制，失去质粒的细菌仍能正常存活。4）质粒可通过接合（conjugation）或转化作用（transformation）等将有关性状传递给另一细菌。5）人工改造的质粒可作为基因工程载体。47微生物染色技术48微生物染色技术2、核糖体（ribosome）1）又名核蛋白体，是散布在细胞质中的一种核糖核酸蛋白质小颗粒，沉降系数为70S。其化学组成70%为RNA（核糖核酸rRNA）rRNA有5S、16S、23S三种，30%为蛋白质。当mRNA连成多聚核蛋白体，就成为合成蛋白质的场所。细菌的70S核糖体由50S和30S两个亚基组成。49微生物染色技术2）链霉素能与细菌核糖体的30S亚基结合，红霉素能与50S亚基结合，从而干扰细菌蛋白质的合成而导致细菌的死亡；真核细胞的核糖体为80S，因此对人体细胞则无影响。50微生物染色技术核糖体（ribosome）RNA和蛋白质沉降系数70s50s+30s（真核80s60s+40s）

链霉素红霉素51微生物染色技术二、特殊结构

（一）糖被（二）鞭毛（三）菌毛（四）芽孢与基本生命活动没多大关系52微生物染色技术（一）荚膜（capsule）

1、某些细菌在其生活过程中可在细胞壁外周产生一层包围整个菌体、边界清楚的黏液样物质，其厚度在200nm以上，称为荚膜。2、如链球菌的M蛋白、沙门氏菌的Vi抗原及大肠杆菌的K抗原等。一团荚膜内含多个细菌时则称为菌胶团(Zoogloea)。53微生物染色技术肺炎链球菌荚膜荚膜54微生物染色技术3、普通染色不易着色，荚膜染色法可见荚膜的存在4、微荚膜（microcapsule），其厚度在200nm以下者，在光学显微镜下才不能直接看到，必须以电镜或免疫学方法才能证明，称为微荚膜。肺炎链球菌荚膜荚膜55微生物染色技术5、黏液层（slimelayer）：有些细菌分泌一层很疏松、与周围边界不明显，易与菌体脱离的黏液样物质。56微生物染色技术6、荚膜的主要成分是水分、多糖、多肽或蛋白质。

多数细菌的荚膜由多糖组成。例：志贺氏痢疾杆菌、肺炎球菌的荚膜由多糖组成；

有些细菌为多肽类，如炭疽杆菌的荚膜成分是一种D-谷氨酸多聚体；

极少数细菌由多糖和多肽两种成分构成。如：巨大芽孢杆菌。57微生物染色技术7、荚膜的产生——有种的特征，也与环境条件有密切关系。8、荚膜——使液体培养基具有粘性；在固体培养基上形成表面细润、有光泽的光滑型(S型)或粘液型菌落。58微生物染色技术9、荚膜的功能抗吞噬和抗体作用：荚膜具有抵抗宿主吞噬细胞和抗体的作用，因而荚膜是病原菌的重要毒力因子。抗有害物质的损伤作用：荚膜处于细胞的最外层，有保护菌体避免和减少受有害物质的损伤作用。营养物质的贮存场所与废物排出之地免疫学实验证明，荚膜具有抗原性59微生物染色技术细菌荚膜粘液层60微生物染色技术肺炎球菌荚膜61微生物染色技术（二）鞭毛（flagella）1、多数弧菌、螺菌、许多杆菌和个别球菌的菌体表面长有1至数10根弯曲的丝状物，称为鞭毛。长度：因细菌种类不同而异，多长于菌体若干倍。62微生物染色技术63微生物染色技术64微生物染色技术2、鞭毛的检查方法：1）直接观察法：

--电镜能直接观察到鞭毛，将细菌作成超薄切片，在电镜下直接观察。

--细菌经特殊的鞭毛染色法，使染料沉积在鞭毛的表面，增大其直径，在光镜下也可看到。65微生物染色技术2、鞭毛的检查方法：1）直接观察法：电镜能直接观察到鞭毛，将细菌作成超薄切片，在电镜下直接观察。特殊染色法，使染料沉积在鞭毛上，增大其直径，在光学显微镜下也可看见。66微生物染色技术细菌鞭毛的电镜照片

鞭毛的光学显微镜照片

周生鞭毛b.极生鞭毛c.丛生鞭毛

67微生物染色技术2）间接检查法：通过观察细菌有无运动力间接地推断其有无鞭毛。普通显微镜悬滴检查法半固体琼脂穿刺培养穿刺线周围混浊扩散，表明该菌有鞭毛；穿刺线周围透明，不混浊，表明该菌无鞭毛。68微生物染色技术无动力有动力半固体培养基（穿刺培养）69微生物染色技术3、根据鞭毛在菌体上的排列，可将有鞭毛的细菌分为四类

1）一端单毛菌(monotrichaete)如霍乱弧菌（Vibriocholerae）。

2）两端单鞭毛菌(amphitrichaete)如鼠咬热螺旋体(Spirochaetamorsusmuris)。

3）丛生鞭毛菌(lophotrichaete)菌体一端或两端各生一束鞭毛，如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；红色螺菌(Spirillumrubrum)。4）周生鞭毛菌(peritrichaete)周身都有鞭毛，如大肠杆菌、枯草杆菌等。

70微生物染色技术单毛菌双毛菌丛毛菌周毛菌71微生物染色技术一端单毛菌周生鞭毛菌丛生鞭毛菌两端单鞭毛菌72微生物染色技术73微生物染色技术74微生物染色技术4、鞭毛的功能1）细菌的运动器官——当有规律的收缩时，引起细菌运动。并非生命活动所必需，极易脱落，有鞭毛的细菌一般在幼令时具鞭毛，老令时脱落。2）鞭毛具有抗原性，常称为鞭毛抗原或H抗原。鞭毛的化学组分主要是蛋白质，只含有少量的多糖或脂类。3）与致病性有关。75微生物染色技术（三）细菌菌毛（pili，Fimbria）

1、概念：多数G－菌和少数G＋，在菌体上生有一种比鞭毛数量多、形状较直、较细、较短的毛发状细丝，也称为菌毛，亦称伞毛或纤毛。菌毛与运动力无关，电镜下才能看到。76微生物染色技术2、菌毛由菌毛蛋白(pillin)组成因机械因素而失去菌毛细菌很快又能形成新的菌毛，因此认为菌毛可能经常脱落并不断更新。77微生物染色技术3、根据菌毛功能可将其分成二大类1）普通菌毛(commonpili)：较纤细和较短，数量较多、遍布整个菌体表面，每个细菌可有数白条功能主要是能使细菌黏附于动植物、真菌以及多种其他细胞上，与致病性有一定的关系。78微生物染色技术仅见于少数革兰阴性菌。数量少，1-4根。比普通菌毛长而粗，中空呈管状。性菌毛由致育因子（F）编码，故又称F菌毛。带有性菌毛的F+菌与无性菌毛的F-菌相遇时，性菌毛与其相应受体结合，F+菌内的质粒或DNA可通过性菌毛进入F-菌体内，此过程——接合(conjugation)性菌毛在F+和F－的接合中是重要的，是供体细菌向受体细菌传递质粒等遗传物质的通道。性菌毛是某些噬菌体吸附于菌细胞的受体。2）性菌毛(sexpilus)芽胞79微生物染色技术F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient接合(conjugation)80微生物染色技术性菌毛图81微生物染色技术（四）芽孢(spore)1、某些细菌在一定环境条件下，可在菌体内形成一个圆形或椭圆形休眠体，称为芽孢。带有芽孢的菌体称为芽孢体(sporangium)，芽孢成熟后可脱落出来，称为游离芽孢。未形成芽胞的菌体称为繁殖体或营养体。生成芽孢的细菌多为杆菌，球菌和螺旋菌仅少数种能生芽孢。83微生物染色技术芽孢的染色使用普通的染色方法，染色不易渗进芽孢内，不能使芽孢着色，未着色的芽孢，因本身折光性强，在普通显微镜下，呈现为物色的空洞状。特殊染色方法可使芽孢着色，一经着色又不易脱色。84微生物染色技术85微生物染色技术2、芽胞的结构芽孢具有较厚的芽孢壁和多层芽孢膜，结构坚实，含水量少，代谢极低，折光性强。86微生物染色技术成熟芽孢的结构示意图（电镜）

87微生物染色技术3、芽胞的形成细菌形成芽胞的能力是由菌体内的