生物工程制药之质量与控制2课件

生物制药工艺

一、生物药物质量评价检查项目的区别：由于多为大分子药物，与化学药有不同，例如需做热原检查、过敏试验、异常毒性等，在定量方法上除了重量法、滴定法、比色法、色谱法等，还有电泳法、酶法、免疫法、生物检定法等。生物药物的评价体系：

质量指标：性状、鉴别、纯度、含量等有效性和安全性：体内吸收、分布、排泄、生物转化、

生物利用度、药物代谢体内过程等。生物药物质量管理与控制生物药物质量管理与控制1.生物药物质检程序与方法1.1药物取样（代表性、真实性和科学性）1.2药物鉴别试验（化学法、物理法和生物学法）1.3药物杂质检测

一般杂质检查：水分、氯化物、硫酸盐、重金属及砷等。

特殊杂质检查：主要指从生产、贮存过程引入或原料带入的杂质，如起始原料、中间体、反应副产物、残留溶剂、异构体、贮存中产生的降解物等。生物药物质量管理与控制1.4药物安全性检查：异常毒性试验、无菌检查、热原检查、过敏试验、降压物质检查等。生物药物还包括：药代动力学和毒理学（致突变、致癌、致畸）研究。1.5药物含量（效价）测定

生物药物含量表示法：

百分含量：适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。

生物效价（或酶活力）：适用于多肽、蛋白质、酶类及生物制品等。1.6检验报告：完整原始记录、真实不涂改、结论明确生物药物质量管理与控制2.药物的ADME表示药物在体内的整个过程。A：absorption吸收D：distribution分布M：metabolism代谢E：excretion排泄药物代谢转化一般分为两类反应：（1）氧化、还原、水解、水合、脱硫乙酰化、异构化等（2）葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、谷胱甘肽结合、乙酰化、甲基化、氨基酸结合、脂肪酸结合、缩合等。生物药物质量管理与控制

药物的体内两类转化反应需要多种酶完成，经过第一类反应，药物分子形成羧基、羟基、醇基、氨基等，便于第二类结合反应，形成极性更高、水溶性更大的代谢产物，利于从肾脏及胆道排出体外。药物经过机体转化，可能发生理化性质改变，从而改变其药理和毒理活性，如代谢失活、代谢活化，使药理活性减弱或增强，甚至产生毒物及致癌物。生物药物质量管理与控制二、药物的质量标准分为：中国药典、卫生部药品标准（部颁标准）、地方药品标准三级。1.药典的内容1.1国家药典一般分为凡例、正文、附录三部分凡例：为正确理解和使用药物的阐述部分，叙述药典中的术语，如溶解度、温度、度量衡单位等。正文：收载药品或制剂的质量标准，包括药品性状、鉴别、检查、含量测定、作用与用途、用法与用量、贮存方法等。生物药物质量管理与控制附录：制剂通则、一般杂质检查方法、一般鉴别试验、物理常数测定、试剂配制法、分光光度法、化学分析法、色谱方法、氧瓶燃烧法、乙醇测定法、电位滴定法、氮测定法、放射性药品检定法、试剂、指示剂、缓冲液和滴定液等配制法、生物测定法和生物测定统计法等。1.2部颁药品标准收载中国药典未收入，但常用的药品和制剂。新批准的药物符合其标准并经过2年试行期后，方可转为部颁标准。

美英则是编副药典，来补充国家药典的不足。生物药物质量管理与控制1.3地方药品标准对药典以外的某地区常用药品、制剂制订的地区性规格和标准。由于药典中规定的标准都是该药物达到的最低标准，生产厂家可制订出高于药典指标的厂家标准。药厂可以采用自身的分析方法来对药品进行品控，但一旦出现问题需要仲裁时，必须以国家药典规定方法为准。生物药物质量管理与控制2.各国药典简介2.1中国药典1953年首版，先后编篡9版，最新版为2010CP。共分三部：收载药品4615种，其中新增1358种。一部：中药，收载2136种，新增990种，修订612种；二部：化学药，2348种，新增340，修订1500种；三部：生物制品，131种，新增28，修订103种。另外，药用辅料标准新增130种。生物药物质量管理与控制2.2《美国药典》USP和《美国国家处方集》NFTheunitedstatespharmacopeiaThenationalformularyUSP首版1820年，自1940年每5年修订一次。NF首版1884年，1938年后每5年修订一次，收载USP中尚未收载的药品和制剂，为美国副药典。1980年首次合并出版。最新版为USP2009和NF27的联合版（2009年），世界多国以此作为标准，具有国际性。另外，《美国药典.药物情报》每年出版一册，分为“医务人员手册”和“病人用药须知”。生物药物质量管理与控制2.3《英国药典》BP与《英国副药典》BPCBritishpharmacopieaThebritishpharmaceuticalcodexBP首版于1894年，自1953年每5年修订一次。BP（2008年）收载3100种药品，分5卷：Ⅰ-Ⅱ卷：原料药Ⅲ卷：制剂及血液制品、免疫制品、放射性药品、外科用材料Ⅳ卷：红外光谱、附录、增补篇和索引Ⅴ卷：兽药生物药物质量管理与控制BPC收录BP中没有的原料药规格标准以及各种详细处方。内容包括药物及药用辅料、免疫产品及有关制剂、手术材料及缝合线、外科辅料、药方制剂等。2.4日本药局方和日本药局方解说书1892年首版，二战前主要以德国和瑞士蓝本制订，二战后偏向于美英，最新版2006年发行，主要分两部：第一部：原料药和基础制剂第二部：生药、家庭药制剂和制剂原料生物药物质量管理与控制2.5国际药典

1951年正式出版国际药典第1部，分英文和法文版。目的是向各国提供指定药典的资料，统一毒、剧药规格、选定国际通用名、供给并确定试验用的标准品等。此后，WHO的主要目的是对各国设置药品质量管理部门和培养GMP管理人员起指导作用，2003出第5部。生物药物质量管理与控制三、生物药物的管理1969年WHO推行《药品生产质量管理规范》GMP，将其作为药品和生物制品进行国际贸易的必备条件。1982年由中国医药工业公司起草我国的GMP；1985年作为行业GMP标准颁布；1985年7月1日，我国颁布药品管理法，规定自1988年开始实施《药品生产质量管理规范》GMP制度；1998年，我国未取得GMP认证企业，不予受理生产新药申请，不批准药品的仿制、新药技术的转让和进口药物的分装，对未取得GMP认证的新企业不发给药品生产企业许可证。生物药物质量管理与控制GMP：goodmanufacturepractice，《良好药品生产规范》，行业也称之为《药品生产质量管理规范》。GMP核心是全员全程管理，人员是生物药物生产的第一要素，生产企业必须建立一个独立质量保证的QA部门，不受行政干扰地执行其法定权力。GLP：goodlaboratorypractice，《良好药品实验研究规范》，也称之为《药品非临床研究管理规范》。GCP：goodclinicalpractice，《良好药品临床试验规范》，也称之为《药品临床研究管理规范》。

生物药物质量管理与控制四、生物药物常用的定量分析法1.酶法包括两种类型：（1）酶活力测定法。目的在于测定药品中某种酶的含量或活性；（2）酶分析法。以酶为分析工具，测定样品中某一物质的含量，如通过酶反应速率测定或对生成物浓度的测定，从而检测出目的物的含量。2.电泳法在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场的作用下以不同的速率向其所带电荷相反的方向迁移，基于迁移率不同达到分离目的。常用包括：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳。生物药物质量管理与控制3.理化测定法包括：重量分析法、滴定分析法、分光光度法、高效液相色谱法等。4.生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用来测定药物的效价或生物活性的一种方法。应用范围包括：（1）效价测定：主要生物活性药品的检测。（2）微量生理活性物质测定：体内（体液）中含量很低，很难用理化方法测定，如神经介质、激素等。（3）有害杂质的限度测定：如内毒素等致热物质和生化制剂中导致降压物质的限度测定。生物药物质量管理与控制五、基因工程药物质量控制1.基因工程药物的质量标准生产过程产生的主要杂质：内毒素、宿主细胞蛋白、蛋白突变体、DNA、氨基酸替代物、内源性病毒、蛋白水解修饰物等。须从基因来源与确证、菌种鉴定、原始细胞库、最终产品等各方面提出质量控制要求，保证产品的有效性、安全性和均一性。1983年FDA制定“重组DNA生产的药品、生物制品的生产和鉴定要点”。1987年欧共体制定“基因重组技术医药产品的生产及质量控制”。1991年WHO公布“重组DNA生产药品、生物制品的生产和鉴定要点”。2000年10月1日颁布执行“中国生物制品规程”生物药物质量管理与控制2.基因工程药物质量控制点2.1原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体、宿主细胞（细菌、酵母、哺乳动物）的检查。（1）目的基因：来源、克隆过程、修饰过的密码子、被切除的肽段、拼接方法、扩增摸板、引物及酶反应条件、基因结构的正确性等。（2）表达载体：载体的生物学性质和来源、构建表达载体各组分（如启动子、起始子、增强子和终止子）的来源与性能、载体结构、遗传特性和抗性标记、载体构建过程的酶切图谱。生物药物质量管理与控制（3）宿主细胞宿主细胞资料包括：细胞株名称来源、传代、鉴定、生物学特征、载体引入宿主细胞的方法、载体在宿主细胞内的性状、是否整合在染色体及拷贝数、宿主与载体结合的遗传稳定性、插入基因和表达载体两侧控制区的核苷酸序列、与表达相关的基因序列、启动外源性基因表达的方法、表达的水平等。

生物药物质量管理与控制质量控制方法包括：表型鉴定：形态学特征、生理生化特性等。抗生素抗性检测限制性内切酶图谱测定（

限制性内切酶图谱(restrictionmap),又称物理图谱(physicalmap),是将各种限制性内切酶的切点在DNA上定位,绘制成的图谱。基因物理图谱的绘制、DNA核苷酸序列分析、基因片段的体外切割等,都需使用限制性内切酶。）序列分析稳定性监控致癌连续性细胞学检测细胞系反转录病毒检测。生物药物质量管理与控制2.2培养过程质量控制（1）建立生产用细胞库

原始种子批、基础种子批和生产种子批。建立原始种子批时，要确证克隆基因DNA序列、记录种子批的来源、培养方式、保存条件、复苏条件和使用期限，提供保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性。克隆基因的DNA序列一般在基础种子阶段予以证实。（2）有限代次生产（3）连续培养过程

测定被表达基因的完整性、长期培养后宿主细胞的完整性；确定最高细胞倍增或传代代次。生物药物质量管理与控制2.3纯化工艺过程的质量控制质量控制要求：去除微量DNA核酸、糖类、残余宿主蛋白、纯化过程可能带入的有害化学物质（如色谱填料是否符合ISO9001）、热原等。2.4终产品的质量控制（1）生物学效价测定通过细胞培养等体外效价误差大，必须有对照品。（2）蛋白质纯度检查HPLC和非还原SDS两种方法测定，至少达到95%生物药物质量管理与控制（3）蛋白质药物的比活性是每毫克蛋白所具有的生物活性，不仅是含量指标，也是纯度指标。由于蛋白质空间结构不能常规测定，而空间结构的改变，特别是二硫键的错配，可影响蛋白的生物学活性，从而影响蛋白质药效，比活性可以间接反应此点。（4）蛋白质性质的鉴定①非特异性鉴别：根据还原性电泳的迁移率和HPLC的保留时间和峰型分析②特异性鉴别：免疫印迹分析（westernblot）,确定其抗原性。生物药物质量管理与控制③相对分子量测定：采用还原型SDS测定，与理论值基本一致，误差范围一般10%左右。④等电点测定：采用等电聚焦电泳测定等电点。批与批之间的电泳结果应该一致，表明生产工艺的稳定性。⑤肽图：一般经蛋白酶或CNBr等试剂裂解后用HPLC或SDS测定。与氨基酸成分和序列分析并用，验证工艺稳定性。⑥吸收光谱：对于某一重组蛋白，最大吸收波长是固定的，所以批次间吸收光谱表现出一致性。⑦氨基酸组成：采用微量氨基酸自动分析仪，试生产前3批或改变工艺时必测。生物药物质量管理与控制⑧氨基酸测序：一般要求对中试前三批产品至少测定N端15个氨基酸，C端根据情况测定1-3个氨基酸。⑨免疫原检查：低免疫原性是衡量重组多肽药物质量高低的一个重要指标。即使重组蛋白氨基酸序列与天然蛋白一致，其免疫原性也可因为空间结构不同高于自然提取的多肽药物，个别氨基酸的改变也可增加其抗原性，如采用大肠杆菌表达系统时，大肠杆菌的氨肽酶常常不能有效去除其产物N端的甲硫氨酸，因而增加了其免疫原性。应设法去除N端的甲硫氨酸。生物药物质量管理与控制（5）杂质检测①蛋白质杂质：除宿主蛋白，目的蛋白发生变化（如污染蛋白酶、冷冻处理过程引发蛋白聚合或错误折叠，形成蛋白变构体）。精制后残留蛋白应小于1/1000，主要采用免疫分析法,辅助电泳印证。生物药物质量管理与控制②非蛋白类杂质：包括细菌、病毒（超滤、微滤）、热原物、DNA热原质主要是革兰氏阴性菌细胞壁组分中的脂多糖，在细胞溶解和细菌生长时会释放出来，其性质非常稳定，即使高压灭菌也不失活残余DNA检测多采用核酸杂交，或利用与DNA高亲和力的结合蛋白进行测定。FDA对残余DNA含量限制小于100pg。PCR也可用于特殊DNA序列的扩增，以检测是否存在某种特定DNA杂质。生物药物质量管理与控制（6）安全性评价：除无病毒、无菌、无热原、无致敏原外，还要进行药代动力学、毒理学研究。根据生物药物结构：Ⅰ）与人类自身生理活性物质完全相同的药品；Ⅱ）与人类自身生理活性物质相似的药品；Ⅲ）与人类自身生理活性物质完全不同的药品。欧盟对上述三类的安全性评价指标非常明确，包括证明一致性、药效、药代动力学、急毒、慢毒、胚胎毒、致畸、致突变、致癌、局部耐受、免疫毒等。生物药物质量管理与控制六、新药研究与开发的主要过程1.主要过程（1）研究计划；（2）准备化合物