液相色谱柱的应用课件

液相色谱柱的应用高效液相色谱培训系列1目录一、液相色谱分离原理二、液相色谱柱的结构三、液相色谱柱的选择四、色谱柱的使用五、分析条件的影响六、色谱柱的维护CompanyLogo2一、

HPLC分离原理样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件)CompanyLogo3分配过程CompanyLogo4分配系数-

K

K=K=常数

（T恒定）

Cm=组分在流动相中的浓度Cs=组分在固定相中的浓度CSCmCompanyLogo5容量因子k

是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——容量因子(capacityfactor)，也称分配比(partitionratio)，以k

表示。

k=Ms/MmMs为组分在固定相中的质量，

Mm为组分在流动相中的质量由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子kCompanyLogo6色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标CompanyLogo7色谱理论：速率理论--影响柱效的因素

速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年提出的,表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程式）。

速率方程

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度；u：流动相的线速度CompanyLogo8色谱理论：速率理论--影响柱效的因素H=A+B/u+C·uCompanyLogo9色谱理论：分离度分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比。

R=2（TR2-TR1）/（W2+W1）计算表明：1：R<0.8时，两组分不能完全分离2：R=1时，两组分峰重叠约2%3：R=1.5时，两组分峰完全分离。R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。降低柱温、增加柱长可使R提高。CompanyLogo10样品组分的分离CompanyLogo11液相色谱的基本流程图流动相

泵色谱柱检测器

泵输液分离

检测

记录AEGBCDF进样阀进样CompanyLogo12HPG-3x00RS泵在整个流速范围下保持800bar高压最高流速达到5ml/minWPS-3000RS自动进样器进样周期15秒进样阀耐压1000barTCC-3000RS柱温箱5-110°C温度范围柱后冷却DAD-3000RS检测器全波长扫描范围数据采集速率100HzAcclaim®2µm色谱柱耐压800barChromeleon®CMS软件及时获得结果UltiMate3000RSLC快速分离液相27/07/202313CompanyLogo13高性能－UltiMate3000x2三元梯度系统有六通道脱气机的溶剂架独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内带温控选项的自动进样器独特的柱温箱可放置两个柱切换阀可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器CompanyLogo14液相色谱柱的应用二、色谱柱的结构和安装CompanyLogo15色谱柱的构造.色谱柱管常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。色谱柱规格内径：常用4.6mm，2.1mm

柱长：常用50，100，150，250cm

CompanyLogo16色谱柱的构造色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。

CompanyLogo17

色谱柱子的构造不同厂家和型号的柱子会有一定的差别CompanyLogo18液相色谱柱的构造在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

CompanyLogo19色谱柱的构造柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用颗粒粒径在3—10µm的范围内。

正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、-NH2、苯基等。

CompanyLogo20液相色谱柱的安装色谱柱的安装：

拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。CompanyLogo21液相色谱柱的安装按柱管上标示的流动相流向，(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的链接管。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。CompanyLogo22连接接管必须注意：如果伸出的管线长度过长，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积CompanyLogo23色谱连接注意事项1.尽量减少死体积CompanyLogo24连接管线与接头<0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中<2.1内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱50mL柱外体积（管线）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321样品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素色谱柱:StableBondSB-C18,4.6x30mm,3.5mm流动相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min温度:35°CCompanyLogo25液相色谱柱的应用三、液相色谱柱的选择CompanyLogo26

分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量>2000分子量<2000低分子凝胶渗透色用硅胶的正相模式用键合相的正相模式CompanyLogo27

1.填料：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等

2.

键合相：

C4、C8、C18、苯基、氨基等（封端技术）3.孔径：60-100A分子量<2000300A分子量>20004.粒径：2um-10um5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）

6.长度：10、15、25、30mm

柱子的选择CompanyLogo28正相&反相色谱正相色谱20%反相色谱80%正相色谱 极性:固定相>流动相 固定相-极性 流动相(正己烷,异丙醇)-非极性 极性物质后出峰反相色谱极性:固定相<流动相 固定相-非极性 流动相(甲醇,水,乙腈,THF,)-极性 非极性物质后出峰CompanyLogo29正相色谱CBACBA

C

B

A

C

B

A低极性流动相中极性流动相极性:A>B>CCompanyLogo30反向色谱法固定相（非极性）C18,C8,C4,苯基流动相(极性)Water,MeOH,MeCN,THF弱酸，弱碱溶剂极性CompanyLogo31各种反相填料的使用比例CompanyLogo32反向色谱法高极性流动相中极性流动相极性:A>B>C

A

BC

A

BCCompanyLogo33流动相1.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。2.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：

正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇最常用的是正已烷，CompanyLogo34不同混合溶剂的粘度比较CompanyLogo35柱填料基质

硅胶基质-pH2~8Al2O3

.nH2O-pH1~14

聚合物基质-pH1~14高pH下,硅胶会溶解低pH下,键合相会断裂化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀，导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损CompanyLogo36

色谱柱的性能参数物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径键合类型碳覆盖率封端化学性质CompanyLogo37色谱柱的物理性质硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸 色谱柱子的长度和内径颗粒形状 球型或不规则型粒径 平均颗粒直径,通常3-10µm表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å

CompanyLogo38硅胶纯度

A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不易发生拖尾一般金属浓度<35ppm);99.995%纯度的二氧化硅CompanyLogo39

A型、B型硅胶比较

A型硅胶化合物被吸收B型硅胶峰型峰高分离正常CompanyLogo40金属敏感测试色谱柱Diamonsil（钻石）C185um，150x4.6mm流动相CH3CN/Water(50:50)流速1.0mL/min检测UV@230nm硅胶中如果存在金属杂质，将与2,3-二羟基萘（峰2）形成金属螯合物，保留时间延长并导致峰形拖尾。2,7-二羟基萘（峰1）不与金属作用并作为内标物。CompanyLogo41色谱柱子的尺寸色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低

•长柱(150-250mm)–运行时间长，分离度高•窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-23mm)-载样量高CompanyLogo42颗粒形状与大小颗粒形状：1球形

2无定形球形粒径---对色谱分离的影响

较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm

3.5µm

5µm

7µm

10µmCompanyLogo43填料粒度

商品化的填料从2μm~30μm目前常用于分析3μm,5μm,10μm用于半制备10μm,15μm用于制备15μm~30μm

3μm

填料CompanyLogo44粒径的影响NFlow3µm5µm10µmCompanyLogo45粒径与柱效CompanyLogo46

核壳U-HPLC的科学原理美国AdvancedMaterialTechnologyInc.Kirkland博士发明。内核1.7um,因此柱效至少相当于UPLC;外层0.5um,总粒径2.7um,因此色谱柱压力接近3.0um色谱柱。CompanyLogo47

流速设定CompanyLogo48色谱柱尺寸和填料粒径的影响1.C184.6*250,5um;242nm,甲醇15%→60%(45min)2.C184.6*150,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(25min)3.C184.6*50,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(10min)CompanyLogo49比表面积与孔径表面积---对色谱分离的影响

高比表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度.比表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要孔径---对色谱分离的影响

大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW2,000,选择100Å的孔径样品MW>2,000,选择300Å的孔径CompanyLogo50比表面积的比较CompanyLogo51比表面积与孔径的影响CompanyLogo52大孔径填料适用于大分子分析大孔径300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽

色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配CompanyLogo53300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300C18(300Å)C18(80Å)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管紧张素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形CompanyLogo54300Å孔径可改善大分子的峰形色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min温度:RT 检测器:UV282nm溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80Å)300SB-C3(300Å)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素)MW.926分子量虽小但体积较大的分子CompanyLogo55色谱柱化学性质键合类型 •单齿键合-键合相分子与基体单点相连 •双齿键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 •与基体物质相连的键合相的量封端

•键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来CompanyLogo56键合类型键合类型对色谱分离的影响

：

单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOCompanyLogo57碳载量碳载量是指固定相中碳的含量不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。一般C18、C18的碳载量为10%~14%，高的可达18%~20%CompanyLogo58碳载量碳载量---对色谱分离的影响

高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长低碳载量：保留弱，缩短运行时间CompanyLogo59碳载量CompanyLogo60封端技术封端---对色谱分离的影响

封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异CompanyLogo61固定相键合二甲基硅烷

封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,

C18,

etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术

CompanyLogo62三基封端技术（酰胺基）PG=极性酰胺基，R1=空间保护的异丙基，R=烷基链柱子稳定性更好，寿命更长CompanyLogo63超临界封端技术传统封端：固-液回流封端，封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中（甲苯），与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等。硅胶小孔难到达。超临界封端：封端试剂和催化剂由CO2超或亚临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态下扩散系数是固-液回流状态的1000倍，能充分扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基。CompanyLogo64碱灭活测试色谱柱Diamonsil（钻石）C185um，250x4.6mm流动相CH3OH/H2O(49:51)流速1.0mL/min检测UV@254nm如果硅胶表面已经被完全化学改性，乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力，所以不会分离并共同洗脱出来。CompanyLogo65封端技术比较CompanyLogo66保留值与pH的关系

pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：C184.6X250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.CompanyLogo67保留值与pH的关系12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱:XDB-C84.6x75mm,3.5µm流动相:44%25mM磷酸,

pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min温度:25°C检测:UV250nm可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化—甚至很小的0.05–0.25个pH变化单位.样品:ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranololibuprofen0.25个pHCompanyLogo68pH值对保留时间的影响碱性条件保留时间随PH变化明显，PH变化0.2，保留时间变化1.2min。保留时间随PH变化不明显酸性条件保留时间随PH变化明显CompanyLogo69保留值与pH的关系保留时间酸性组份中性组份碱性组份CompanyLogo70复杂组分的流动相pH选择技巧色谱柱:Extend-C184.6x150mm,5mm流动相:30%缓冲液:70%MeOHpH7缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液20mMTEA流速:1.0mL/min

温度:RT 检测器:UV254nm0512,345Time(min)76C18pH71.Maleate马来酸盐2.Scopolamine东莨菪碱pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黄碱pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol内径ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0C18pH1105101234Time(min)657高pH下,碱性成分的保留增加待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性CompanyLogo71液相色谱柱的应用四、色谱柱的使用CompanyLogo72色谱柱的评价

CompanyLogo73色谱柱的评价

CompanyLogo74溶剂前处理过滤：0.45um或0.22um孔径滤膜

目的：除去流动相和样品溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。试剂纯度：采用“HPLC”级溶剂对试样有适宜的溶解度CompanyLogo75溶剂前处理脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：

1）柱流量不准

2）检测器基线波动

返回CompanyLogo76基线问题分析CompanyLogo77液相色谱柱的使用平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇（乙腈）的。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷（正己烷）中的。如果需要使用含水的流动相，使用流动相之前用异丙醇过渡。CompanyLogo78液相色谱柱的使用新色谱柱的平衡方法：首先用0.3ml/min的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流速逐步升高到1.0ml/min冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态，这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。CompanyLogo79液相色谱柱的使用日常平衡色谱柱反相色谱柱使用10~20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线，如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用90%甲醇或乙腈过渡。缓冲盐或离子对试剂度需要较长的时间来平衡。

正相色谱柱在使用10~20倍柱体积有机溶剂后用流动相平衡直到基线平稳。如果需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用异丙醇过渡CompanyLogo80色谱柱柱内体积和平衡时间

4.6x50 0.5mL5min 4.6x30 0.3mL3min 4.6x150.15mL1.5min 4.6x1501.50mL15min

2.1x500.10mL5min 60sec 2.1x300.06mL3min 36sec 2.1x150.03mL1.5min18sec色谱柱尺寸柱内体积平衡时间 流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色谱柱尺寸柱内体积平衡时间流速

(mm)(Vm)0.2mL/min1.0mL/min单次样品运行时间=分析时间+色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间=10倍柱内体积÷流速CompanyLogo81液相色谱柱的使用流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。CompanyLogo82

USP允许调节的色谱条件范围色谱柱子长度：70%色谱柱子内径：±25%粒径：可减少50%流速：±50%柱温：±10℃流动相比例：较小比例的成分±30%缓冲盐的浓度：±10%流动相PH：±0.5检测波长：不允许改变CompanyLogo83五、分析条件调整的影响CompanyLogo84流动相调整的基本原则（等度）（1）由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

（2）三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

（3）微调比例：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

CompanyLogo85样品溶剂溶解强度的影响

样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰色谱柱:ZORBAXC18,4.6x150mm,5um流动相:82%H2O:18%ACN检测波长:215nmA. 样品溶剂 100%乙腈010Time(min)12B. 样品溶剂 流动相010Time(min)12样品:(安痛片)1.咖啡因2.水杨酰胺CompanyLogo86样品溶剂溶解强度的影响0.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.022.1-10.00.010.020.030.040.050.060.0minmAU1-2.9572-12.1803-18.067WVL:254nm戴安Ultimate3000色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm流动相：磷酸二氢钠6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氢氧化钠溶液调PH至7.0-甲醇（75：25）检测波长：254nm流速：1.0ml/min样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：峰前伸和裂分峰1.溶剂峰2.4-N-去甲基安乃近3.安乃近溶剂：100%甲醇溶剂：80%甲醇CompanyLogo87缓冲液对中性物质的影响色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C18,4.6x75mm,3.5µm流动相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min 温度:25°C 检测:UV250nm含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形.A=水A=水+25mM磷酸盐缓冲液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)1酮2泊金乙酯3可的松4诺洛芬5泊金丙酯6普萘洛尔7布洛芬CompanyLogo88增加缓冲液浓度减少拖尾02.55.07.5Time(min)12345602.55.0Time(min)123456色谱柱: EclipseXDB-C84.6x150mm,5um流动相: 40%磷酸盐缓冲液 60%ACN流速: 1.5mL/min.温度: 40°CUSPTf1.621.651.631.771.831.1210mM磷酸盐pH7.0USPTf1.411.501.331.391.361.0025mM磷酸盐pH7.0在中等pH下,离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾随缓冲盐浓度升高，Rt降低CompanyLogo89

流动相pH值的选择酸性分析物：pH≤pKa-2碱性分析物：pH≥pKa+2CompanyLogo90反相HPLC常用缓冲液缓冲液 pKa pH范围磷酸盐pK1 2.1 1.1~3.1柠檬酸盐pK1 3.1 2.1~4.1甲酸盐 3.8 2.8~4.8柠檬酸盐pK2 4.7 3.7~5.7乙酸盐 4.8 3.8~5.8柠檬酸盐pK3 5.4 4.4~6.4磷酸盐pK2 7.2 6.2~8.2羟甲基甲胺 8.3 7.3~9.3氨 9.2 8.2~10.2硼酸盐 9.2 8.2~10.2甘氨酸 9.8 8.8~10.81-甲基-哌啶 10.3 9.3~11.3四氢化吡咯 10.5 9.5~11.5二乙胺 10.5 9.5~11.5三乙胺 10.7 9.7~11.7磷酸盐pK3 12.3 11.3~13.3缓冲液的一般有效缓冲范围为PK±1pH。

CompanyLogo91三乙胺对碱性成分峰形的影响02.55.0Time(min)12345色谱柱:XDB-C8,4.6x150mm,5mm流动相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.温度:35°CUSPTF5%1.1.29 2.1.333.1.634.2.355.1.57NoTEA10mMTEAUSPTF5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421样品:1.去甲麻黄碱2.麻黄素3.苯丙胺4.

脱氧麻黄碱5.苯丁胺CompanyLogo92酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱:ZORBAXStableBondSB-C184.6x150mm,5mm流动相:40%A:60%ACN流速:1.0mL/min.温度:室温样品:异丁苯丙酸，pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸pH2.50.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:

乙酸和三氟乙酸均能作为酸性调节剂加至流动相中

CompanyLogo93柱容量对峰型的影响

41.4mmoverloaded4.6mmoverloaded4.6mmCompanyLogo94液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱尺寸:4.6x250mm5µmUV:254nm