食品卫生微生物检验的质量控制课件

食品卫生微生物检验的

质量控制整理ppt实验室质量控制规范-

食品微生物检测BG/T27405-2008实验室的质量控制包括的内容：--人、机、料、法、环。整理ppt人员技术专业培训；生物安全培训；检验技能的客观评估(内部质量控制、能力验证或标准菌株测试、新方法使用前的操作技能评估)。整理ppt仪器设备普通玻璃器皿的灭菌、消毒；测量设备、定容器具的校准与维护；特殊设备的验证与性能评估(标准菌株、实验室间的比对)。整理ppt试剂与材料培养基的制备与性能测试；标准试剂、标准培养物的保存(可追溯性、有效期限、老化、退化或变异、污染)。整理ppt检验方法与质量控制规范管理体系、质量体系的运行；标准方法的有效性；非标方法的确认与验证；实验室内部质量控制与外部质量评估；不确定度的测量。整理ppt实验室环境监测总体布局(满足工作量、对样品无污染、对人员无伤害可能)；不同的工作区域划分；温度、湿度、照度、噪声、洁净度符合检验与生物安全要求；整理ppt食品卫生微生物学检验的

培养基质量控制原则整理ppt培养基的起源与发展微生物培养基(CultureMedia)，是指由人工方法配制而成，用于微生物培养、分离、鉴别、保存、药敏试验等的混合营养物制品。十九世纪未，德国著名细菌学家科赫(RoberKock，1843~1910)成功地制备固体培养基，并发明了玻璃培养皿，极大地推动了细菌的分离、培养和鉴别。整理ppt美国Difco公司至今已有100多年历史，早在1895年就开始生产胃酶、胰酶制品，1917年生产脱水培养基。英国Oxid公司1950年开始商品化生产干燥培养基。Difco和Oxid的产品被全球微生物实验室广泛接受，产品达400多种。我国1958年开始研制干燥培养基，目前已有50多个生产厂家，商品干粉培养基达200多种。整理ppt培养基质量控制的意义培养基的质量直接关系到样品的检验结果。微生物的检验与研究是否成功，在很大程度上取决于培养基的质量。培养基质量是保证实验结果的准确性、科学性、公正性的根本。高质量的培养基可提高工作效率、降低使用成本。整理ppt国际通用的培养基质控标准目前国际上通用的培养基质控标准：ISO/TS1113-1：2000；ISO/TS1113-2：2003。食品和动物饲料-培养基制备指南-实验室培养基制备质量保证通则。食品和动物饲料-培养基制备指南-培养基性能测试实用指南。整理ppt国内现行的培养基质控标准SN/T1538.1-2005；SN/T1538.2-2007。培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南WS/T232-2002商业性微生物培养基质量检验规程。卫生部1993年颁布的“食品卫生微生物检验用干燥培养基生产质控和质量标准”。整理ppt培养基实验室配制的基本程序检查与称量测定及矫正PH溶化(水化)无菌检验、性能检验分装灭菌密封性、日期、说明、配方蒸馏水、加热惰性容器、＜500mL25℃,灭菌后

pH±0.21MNaOHor1MHCl121℃,15min.一般用NaOH调节时，灭菌后pH会下降0.1~0.2，用NaHCO3调节时，灭菌后pH会上升0.1。干粉培养基不需调节pH。整理ppt培养基制备前的准备实验室收到培养基后，建立实验室检查记录单：--培养基的名称和批号；--接收日期及有效期；--包装及其完整性。整理ppt贮存时，建立实验室保存有效培养基的目录清单：

--贮存条件(温度、时间)；--容器密闭性复查；--首次开封日期；--内容物的感观检查(粉未的流动性、均匀性、色泽、结块)。整理ppt培养基实验室制备通则水--配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，以排除测试条件下抑制或影响微生物生长的物质。--如果蒸馏水是用氯消毒的水制备的，在蒸馏前应先对氯进行中和。--为保证蒸馏水的质量，蒸馏水的电阻率最少应达到3000000Ωcm。整理ppt--采用离子交换器（去离子）生产的去离子水，微生物含量较高，这种水在过滤灭菌后仍可能带有细菌生长的抑制因子。所以配置培养基时最好不要使用这种方法生产的去离子水，而应使用蒸馏水。--盛放蒸馏水的容器最好是由中性材料制成的（如中性玻璃，聚乙烯等），在初次使用前要确认容器中不含有任何抑制因子。整理ppt称重和复水--操作人员的自我防护：注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末。--严格按产品说明书准确称量。--称量所需量的脱水培养基，先加入适量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后加水至所需的量。--尽量在湿度较低的房间中称量，以避免培养基受潮。整理ppt溶解和分装--脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时重新溶解。--含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。--用各种成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。整理pptpH值的测定和调整--培养基灭菌冷却到25℃时，pH的变化不应超过0.2个单位。--用稀酸或稀碱（1mol的NaOH或Hcl）将其pH调至要所需要求。--不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。--测定pH的温度为25℃。--商品化的培养基高压灭菌前后pH可能变化很大，但采用优质蒸馏水或去离子水，灭菌前无需调节pH。整理ppt分装--将配好的培养基分装到适当的容器中，根据不同用途，容器的体积可为培养基的1倍、2倍或3倍。容器的选择：--在使用过程中不会释出改变培养基pH的物质。--不得使用铜锅或铁锅(当培养基的含铜量>0.3mg/1000mL时，细菌不易生长。当含铁量>0.14/1000mL时，则防碍细菌毒素的产生)。--容器应有留有足够的空间(一般至少为培养基总体积1倍以上)。整理ppt灭菌--培养基和试剂应采用湿热灭菌法或过滤除菌。--亮绿培养基等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，只能煮沸灭菌。煮沸后应迅速冷却，避光保存；--明胶、血清、糖类等不耐高温的物质，应采用高压锅低温灭菌法/间歇灭菌法灭菌；--有些试剂则不需灭菌，可根据相关标准或供应商使用说明直接采用。整理ppt湿热灭菌--高压灭菌一般采用121℃灭菌15分钟。当培养基体积超过1000mL时，要对灭菌条件进行适当的调整，但应按照标准或使用说明的规定进行。--高压灭菌过程要通过放置到特定位置的热电耦或测试条件进行监测，以保证灭菌的效果。--灭菌效果的控制是关键。加热后采用适当的方式冷却，以防加热过度。这对于肠道菌培养基和大容器中的培养基等的灭菌十分重要。整理ppt过滤灭菌--过滤除菌可在真空负压或加压的条件下进行。使用孔径为0.22μm的滤膜或过滤器。--过滤前先将滤膜和滤垫灭菌。过滤器于121℃下灭菌15min(可以整体灭菌也可以拆卸后灭菌)，灭菌后在无菌条件下组装。--一些滤膜上附着有蛋白质（如抗生素）。为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。整理ppt监测--应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。整理ppt添加成分的制备--制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时应小心操作（必要时在通风柜中操作），避免因粉尘的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应；--制备溶液时应小心按产品使用说明操作；不要使用过期的产品；--抗生素工作溶液应现用现配；批量配置的抗生素溶液分装后冷冻贮存，但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻；--厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。整理ppt培养基的使用--将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。--经过高压的培养基应尽量减少重加热时间，避免过度加热。--培养基融化后放入47℃±2℃的恒温水浴锅中保温，直至使用。--融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4小时。整理ppt添加成分的加入--对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃±2℃时再加入。--无菌的添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。--将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀，尽快分装到待用的容器中。整理ppt平板的制备和储存--倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂板（直径90mm的平皿，通常要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。--在培养过程中，培养基会损失水分。当水分损失的量大于培养基总量的15%时，就会影响微生物的生长。整理ppt--造成培养基水分损失的因素很多，如培养基成分，平皿中培养基总量和培养箱的类型等（如使用带风扇的培养箱，培养箱中的湿度偏低，平板在培养箱中放置的位置靠近加热管，培养温度过高等)，操作时应注意避免。--凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）4℃~12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按厂商提供的标准执行。在平板底部做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。整理ppt--将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长贮存期限。--为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。--对于采用表面接种形式培养的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱/培养箱中（温度设为25℃~50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。--注意不要过度干燥。商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。整理ppt培养--培养时每垛最多堆放六个平板，平板间要留空隙以保证空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致；--液体培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养箱类型等，如有特殊要求应先将液体培养基预热至所需温度再接种；--使用厌氧罐时，堆放的平板数可以超过六个。整理ppt培养基的弃置--所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。--应根据相关法律法规和标准的要求以及各实验室的实际情况，在所指定的药品试剂安全管理规范当中加入有关培养基弃置的具体要求，以确保所弃置培养基的安全性。整理ppt培养基成品的质量控制供应商或制备者应确保培养基的理化特性满足相关标准的要求：--外观，色泽和均一性；--琼脂凝胶的硬度；--水分含量；--pH；--缓冲能力；--微生物污染。整理ppt微生物学要求-选择能代表整批产品的样品进行微生物学性能测试。定量：采用采用定量方法时，应使用参考培养基进行对照；(多用于固体培养基)。半定量：采用半定量和定性方法时，可使用参考培养基或能得到“阳性”结果的培养基进行对照有助于结果的解释；(多用于液体培养基)。参考培养基应是从近期批次中选出的已知质量良好的培养基。培养基稳定性测试应使用来自不同供应商的培养基或即用型培养基。

整理ppt培养基的性能测试需要进行性能测试的培养基主要包括：选择性培养基、非选择性培养基和鉴别培养三大类。固体培养基一般采用定量的方法进行测试；液体培养基多采用半定量的方法测试；鉴别培养基主要用定性方法。整理ppt选择性培养基的性能测试选择性培养基包括：选择性增菌液、选择性分离培养基。测试项目：--生长率；--选择性；--特异性。测试方法：定量、半定量、定性。整理ppt非选择性培养基的性能测试非选择性培养基：基础培养基、营养培养基。有液态和固态两种。测试项目：--生长率。测试方法：定量、半定量、定性。整理ppt鉴别培养基的性能测试鉴别培养基：用于对微生物进行生化鉴定的培养基。根据不同的鉴别培养基(如高层斜面固体、半固体、液体、微量生化管等)，采用不同方法接种特定的标准菌株，观察具特征性的生化结果。测试方法：定性。整理ppt测试菌株应具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购置于标准菌种保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。实验室应检测和记录标准储备菌株的特性；新复苏的菌株可能会有非特异性反应，使用时应引起注意；最好使用从食品中分离的菌株。培养基性能测试的质控菌株要求整理ppt每种培养基的测试菌株应包括：--具典型反应特性的(强阳性)菌种；--微弱生长的阳性菌株（对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）；--非特异性菌株。如：产生不同发酵反应和荧光反应的菌株；--阴性菌株。质控标准菌株的复苏应按医用细菌菌种复苏方法进行。如果菌株失去原有的特性，则视为菌株变异，不能使用。整理ppt从菌种保藏中心得到的菌株为零代，菌株启开后应分为二份，一份供保存菌种用，一份供存代用为工作菌株。工作菌株使用不超过5代。复苏后的菌种一般在传1~2代后使用。整理ppt工作菌株的制备工作菌株是将标准储备菌株接种到非选择性肉汤中所制备的处于稳定生长期的纯菌株，也可以采用其他制备方法，但要保证接种菌株的纯度和操作的规范性，以确保工作菌株的可靠性。如经过冷冻的菌株复苏后能在选择性培养基上存活，则该菌株可以使用。整理ppt生长率测试用工作菌株：生长率试验的目标菌(定量或半定量)常用每平板（或试管）的接种水平为10CFU～100CFU。选择性测试用工作菌株：培养基选择性试验是将浓度为104CFU/mL～106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种到平板上或试管中。

整理ppt生长率(定量法)将适量测试菌株(目标菌)的工作培养液，分别接种(可采用涂布法或倾注法)于待测培养基和参考培养基中(一般每种培养基接种三块平行板)；按相关标准规定的条件进行培养。计算每一平板中的菌落数，评价菌落的大小和表面特征。--生长率PR的计算：PR＝NS／N0--NS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。--N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上得到的菌落总数(该菌落总数应≥100cfu)。整理ppt每种培养基上菌株的生长率应达到所规定的最低限值。非选择培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1。通常应达到这个要求，特殊情况可放宽判定标准。整理ppt生长率(半定量法)按常规的方法用大约15mL琼脂培养基制备平板。用1μl接种环按图将工作培养液划线接种平板。A部分用接种环按0.5cm的间隔划4条平行线，按同样的方法在B区和C区划线，最后在D区内划一条连续的曲线。按相关标准规定的条件进行培养。整理ppt操作时用接种环而不用接种针，接种环应完全浸入培养基中。取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次可去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为20°～30°；接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续；移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。通常用同一个接种环对A～D部分进行划线，操作过程不需要对接种环灭菌。整理ppt计算：培养后，评价菌落的形状、大小和生长密度，并计算生长指数G。每条有菌落生长的划线记作1分，每个培养皿上最多为16分。如果仅一半的线有菌落生长，记作0.5分。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则记作0。记录每个平板的得分总和便得到G。整理ppt结果解释：--目标菌的生长指数G大于6时，培养基可以接受。非选择培养基的G值通常较高；--目标菌在培养基上应呈现典型的生长；--而非目标菌的生长应部分或完全被抑制。整理ppt选择性(定量法)将适量测试菌株的工作培养物，涂布接种至选择性培养基和参考培养基中。按相关标准规定的条件进行培养。选择因子的计算：SF＝D0－DS--D0：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度的对数。--DS：能在待测培养基上显示生长的最高稀释度的对数。整理ppt非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2。通常应达到这个要求，特殊情况时可以放宽判定标准。整理ppt选择性(定性)按常规的方法用大约15mL琼脂培养基制备平板；用1μl接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉；也可使用其他划线技术；按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养。整理ppt结果解释：非目标菌的生长应该被部分或全部抑制（1或0）。--培养后按以下方法对培养基计分：--0表示无生长；