项目2-精液的处理12

微带交指带通滤波器设计与仿真2013届学士论文毕业答辩《动物繁殖技术》

动物遗传繁育教研室项目二精液的处理

任务一

精液的品质评定

任务二

精液的稀释

任务三

冷冻精液的制作

任务四

精液的保存与运输

精液的质量控制和品质保证是影响人工授精效果的关键技术环节，精液的稀释、保存和运输等环节均可影响精液的质量，精液的品质分析又易受环境、检测人员的技术熟练程度及主观判断能力等诸多因素影响而发生偏差，因此精液处理必须严格按照规范程序进行。学习目标知识目标：了解精液的理化特性，熟悉精子的形态结构及生理特性理解外界因素对精子存活的影响理解稀释液的主要成分及作用理解精液的保存原理了解液氮的特性及液氮罐的结构理解性控冻精生产的技术原理技能目标：熟练评定精液的品质能熟练确定精液的稀释倍数会筛选稀释液的配方，并能正确熟练地配制稀释液会正确稀释精液根据国标（GBT4143-2008）规范制作牛的冷冻精液会进行猪精液的保存和运输能正确运输冷冻精液任务一

精液的品质评定

某公猪站，采精时用4～6层消毒纱布滤除胶状物质，然后置于37℃恒温水浴锅中进行品质鉴定。经检测，本次采集精液300mL，乳白色，略有腥味，精子活率为0.7，精子密度为2亿／mL，精子畸形率为12％。试分析该精液是否能用于配种？任务描述子任务一

精液的感官评定任务实施一、准备工作采集精液做好标记并置于37℃温水或保温瓶。二、检查与评定采精量：盛放在带有刻度的集精杯或量筒中。颜色：正常为乳白色或灰白色（血精、尿精、炎症）。气味：略带腥味。云雾状：牛、羊精液云雾状较明显。动物种类一般采精量（mL）范围（mL）奶牛5～100.5～14肉牛4～80.5～14水牛3～60.5～12山羊0.5～1.50.3～2.5绵羊0.8～1.20.5～2.5猪150～300100～500马40～7030～300鸡0.5～1.00.2～1.5子任务二

精子活率评定任务实施一、准备工作显微镜（全自动精子分析仪）、保温箱、载玻片、盖玻片、玻璃棒等。子任务二

精子活率评定任务实施二、评定方法平板压片法：玻璃棒蘸取1滴原精液或经生理盐水稀释的精液，滴在载玻片上，呈45°盖好盖玻片（避免气泡），置于显微镜下观察，估测呈直线运动的精子数占总精子数的百分率。悬滴法：取一小滴精液滴于盖玻片上，迅速置于凹玻片的凹窝上形成悬滴片（结果可能偏高）。三、结果评定（十级评分：0-1.0）鲜精：0.7-0.8液态保存：0.6冻精：0.35子任务二

精子活率评定任务实施四、注意事项牛、羊和鸡的精液密度较大，可用生理盐水稀释后再检查。活率是评价精液品质一个重要指标，与受精力密切相关，一般在采精后、精液处理前后及输精前都要进行检测。温度对精子活率影响较大，要求检查温度在37℃～38℃左右，如果没有保温装置的，检查速度要迅速，在10秒内完成。精子活率评定带有一定的主观性，应观察2～3个视野，取其平均值。子任务三

精子密度评定任务实施一、估测法

1.准备工作器材的准备：显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃棒、擦镜纸等。精液的准备：新鲜的精液。

2.检查方法

取1小滴精液滴于清洁的载玻片上，盖上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，不得存留气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置于显微镜下放大400倍观察精子间的空隙。通常结合精子活率评定进行。精子密度又称为精子浓度，是指每毫升精液中所含有的精子数。子任务三

精子密度评定任务实施一、估测法

3.结果评定密（>10亿）中（2亿～10亿）稀（<2亿）4.缺点

各种动物精子密度差异较大，标准不统一，且主观性和误差也较大，但简便易行，在基层人工授精站常采用。子任务三

精子密度评定任务实施二、血细胞计数法

1.准备工作器材的准备：显微镜、血细胞计数板、盖玻片、移液器、小试管、胶头滴管、计数器、擦镜纸等。试剂的准备：3％的NaCl溶液。精液的准备：新鲜的精液。子任务三

精子密度评定任务实施二、血细胞计数法

2.检查方法清洗器械：先将血细胞计数板及盖玻片用蒸馏水冲洗，使其自然干燥。稀释精液：用3%NaCl溶液稀释，牛、羊精液一般稀释100、200倍，猪的精液稀释10、20倍。找准方格：在低倍镜下查看方格外貌（由25个中方格组成，每个中方格又有16个小方格），再用高倍镜查找其中一个中方格（四角中的一个）。计数室结构子任务三

精子密度评定任务实施二、血细胞计数法

2.检查方法镜检:将稀释好的精液滴一滴于计数室上盖玻片的边缘，使精液自动渗入计算室，静置3min检查，计数具有代表性的5个中方格内的精子数。一般计数四角和中间一个（或对角线五个）。子任务三

精子密度评定任务实施二、血细胞计数法

2.检查方法计算:1mL原精液的精子数=5个方格内的精子总数×5×10×1000×稀释倍数。子任务三

精子密度评定任务实施二、血细胞计数法

3.结果评定

正常情况下，羊精子20亿～30亿；牛精子10亿～15亿；猪2亿～3亿。

该法因检测速度慢，在生产上用得较少，但结果准确，一般都用于结果的校准及产品质量的检测。

4.注意事项血细胞计数板一定要清洗干净；滴入精液不要溢出于盖玻片之外，也不可出现有气泡或干燥之处；计数时，以头部压线为准，按照“数头不数尾、数上不数下、数左不数右”的原则，避免重复或漏掉。为了减少误差，应连续检查两次，取其平均值，若两次计数误差大于10%，则应做第三次检查。

子任务三

精子密度评定任务实施三、精子密度仪测定

将待检精液样品按一定比例稀释，置于精子密度仪读取结果，与标准管比较或查对精液密度对照表，确定样品的精液密度。此法快速、准确、操作简便，广泛用于畜禽的精液密度测定。精子密度测定仪子任务四

精子畸形率评定任务实施一、准备工作器械的准备：显微镜、载玻片、计数器、染色缸、镊子、玻璃棒、擦镜纸。试剂的准备：蓝（红）墨水、96%酒精等。精液的准备：新鲜的精液或冷冻保存的精液。子任务四

精子畸形率评定任务实施二、检查方法1、抹片：以玻璃棒蘸取精液一滴，滴于载玻片一端，以另一载玻片顶端呈35°角，抵于精液滴上，向另一端拉去，将精液均匀涂抹于载玻片上。2．干燥

抹片于空气中自然干燥。3．固定

置于96%酒精固定液中固定5～6min，取出冲洗后阴干。4．染色

用蓝（红）墨水染色3～5min，缓慢水流冲洗干净并干燥。5．镜检

将制好的抹片置于400倍显微镜下，查数不同视野的300～500个精子，记录畸形精子的数量，并计算精子畸形率。子任务四

精子畸形率评定任务实施三、结果评定

正常情况下，精液中有一定比例的畸形精子，一般牛、猪不超过18%，羊不超过14%，马不超过12%。否则，视为精液品质不良，不能用于输精。任务二

精液的稀释

精液稀释是人工授精中的一个重要技术环节，只有经过稀释的精液，才适于保存、运输及输精。精液的保存方法不同，稀释的倍数及稀释液的成分也不相同。如何确定精液的稀释倍数？配制稀释液时需加入哪些成分呢？任务描述

[案例1]：某公猪站一种公猪，一次采得鲜精300mL，经检查精子活率为0.7，精子密度为2.0亿／mL。此公猪精液能给多少头母猪输精？（人工授精正常输精量为：80～100mL，每份精液一般含有30亿～50亿个精子）母猪一次输精量以100mL（含有40亿精子）为例：

解1：

输精头份为：（300mL×2.0亿／mL）÷40亿=15（头份）

稀释倍数为：100mL×15÷300mL=5（倍）

解2：

稀释后精液的密度为：40亿÷100mL=0.4亿／mL

稀释倍数为：2.0亿／mL÷0.4亿／mL=5（倍）

输精头份为：300mL×5÷100mL=15（头份）

需配制稀释液的量为：15×100mL-300mL=1200mL。任务实施一、确定稀释倍数任务二

精液的稀释

[案例2]：某公牛站，2009152号种公牛于5月12日早八点采集鲜精10mL，经检查精子活率为0.7，精子密度为11.5亿／mL。将精液制作成细管冻精，要求每支细管冻精容量为0.25mL，其中解冻后有效精子数不少于1000万。请确定稀释倍数，并计算本次所采集的精液经处理后能制成细管冻精多少支？

《牛冷冻精液》国家标准（GBT4143-2008）规定，牛冷冻精液细管型容量为0.25mL，解冻后精子活率≥0.35。

解1：稀释前精子密度为：11.5亿／mL

细管冻精每毫升精液有效精子数为：0.1亿／mL÷0.25=0.4亿／mL

细管冻精精子密度为：0.4亿／mL÷0.35=1.14亿／mL

稀释倍数为：11.5亿／mL÷1.14亿／mL=10（倍）

细管支数为：10mL×10÷0.25mL=400（支）

解2：一支细管的精子数量为：0.1亿÷0.35=0.285亿

细管支数为：10mL×11.5亿／mL÷0.285mL≈400（支）

稀释倍数为：400×0.25mL÷10mL=10（倍）任务实施一、确定稀释倍数任务二

精液的稀释

任务实施二、配制稀释液任务二

精液的稀释（一）猪稀释液的配制1．商品化猪精液稀释液稀释粉质量指标：各成分均达到分析纯级别，非水溶性物质不超过10mg/kg，不含重金属离子（短期：2～4d，中期4～5d，长期5～7d）。稀释用水要求：蒸馏2次以上的新鲜蒸馏水（pH为7.0），不可用矿泉水、纯净水或饮用的蒸馏水。稀释液配制：稀释前1～2h配制，完全溶解后静置40～50min，水温要求25℃～35℃，不超过40℃。

任务实施二、配制稀释液任务二

精液的稀释（一）猪稀释液的配制2．自配稀释液成分BTSKiew葡萄糖（g）3760碳酸氢钠（g）1.31.2氯化钾（g）0.4­柠檬酸钠（g）63.7EDTA（g）1.33.7蒸馏水（mL）10001000青霉素、链霉素每1000mL加青霉素、链霉素各50万-100万IU稀释液配方任务实施二、配制稀释液任务二

精液的稀释（一）猪稀释液的配制2．自配稀释液准备工作：器械的准备：电子天平、水浴锅、显微镜、量筒、烧杯、三角烧瓶、水温计、漏斗、玻璃棒、定性滤纸等。稀释液的配制玻璃器皿的清洗与消毒配制稀释液：按照配方准确称量药品放在烧杯中，加入1000mL蒸馏水使其充分溶解，过滤后置于100℃消毒10～20min，取出冷却至40℃以下，加入青霉素、链霉素各50万～100万IU，混合均匀。任务实施二、配制稀释液任务二

精液的稀释（二）牛冷冻精液稀释液的配制

稀释液配方成分基础液葡萄糖蒸馏水7.5g100mL稀释液基础液卵黄甘油青霉素链霉素75mL20mL5mL1000IU/mL1000IU/mL稀释液的配制玻璃器皿的清洗与消毒。配制基础液:准确称取7.5g葡萄糖溶解于100mL蒸馏水，溶解、过滤并消毒。取卵黄：鸡蛋新鲜，洗净、消毒，在气室端敲一小孔，将蛋清倒净，剥取蛋壳暴露卵黄，吸取卵黄20mL。配制稀释液

取75mL冷却基础液，分别加入卵黄20mL、甘油5mL、青霉素10万IU、链霉素10万IU，混合均匀。任务实施三、正确稀释精液任务二

精液的稀释确定倍数一般在采精后0.5h内进行稀释液和精液同温处理：30℃将稀释液沿瓶壁缓慢倒入精液，轻轻摇动，混匀高倍稀释时应分次进行稀释后镜检，若活力下降，操作不当任务实施四、稀释液配制注意事项任务二

精液的稀释器具必须彻底清洗，严格消毒。选用新鲜的蒸馏水。药品试剂要纯净。奶液和奶粉需新鲜：脱脂棉过滤，再水浴加热到92℃～95℃消毒灭菌10min，降温后除去奶皮备用。鸡蛋要新鲜，卵黄中不应混入蛋白和卵黄膜：经加热消毒过的稀释液，待温度降至40℃以下再加入卵黄，并注意充分溶解。抗生素、酶类、维生素、激素等需在稀释液加热灭菌后温度降至40℃以下加入，磺胺类可事先加入稀释液，一并加热消毒。稀释液最好现用现配。如需贮存，经消毒、密封后放入0℃～5℃冰箱可保存2～3d，最长不超过1周，但卵黄、奶类、活性物质及抗生素须在临用前添加。任务三

冷冻精液的制作

利用液氮作为冷源，将特殊处理的精液长期保存，便于长时间保存和远距离运输，主要有颗粒和细管两种剂型，后者不易污染、便于标记、适于机械化生产、解冻和输精也比较方便，生产上普遍使用，牛的细管冻精多用0.25mL剂型。

任务描述

某奶牛育种中心，现有来自美国、加拿大、澳大利亚以及以色列等国家的优秀荷斯坦种公牛约80头，其中采精公牛60头，严格按照GBT4143-2008以及牛冷冻精液检测技术规程，每年制作冻精100多万剂。1、采精及精液品质检查：按国标要求选择公牛，精液品质检测要求活率不低于0.7，密度不少于8亿／mL，畸形率不超过15％。2、稀释精液：一次稀释法：将配制好的含有卵黄、甘油的稀释液按一定比例加入精液中，适用于低倍稀释。两次稀释法：为了缩短甘油与精子的接触时间，常采用两次稀释法。首先用不含甘油的稀释液Ⅰ和精液放入30℃环境进行同温处理，并按稀释倍数进行半倍稀释；然后把稀释精液连同稀释液Ⅱ一起缓慢降温至0℃～5℃，并在此温度下进行第二次稀释。任务实施一、准备工作任务三

冷冻精液的制作3、精液分装颗粒精液：将稀释好的精液直接进行降温平衡，不必分装；细管精液：利用细管冻精分装机对精液进行机械化分装，细管冻精的剂型有0.25mL、0.5mL和1.0mL，现生产中牛的细管冻精多用0.25mL剂型。任务实施一、准备工作任务三

冷冻精液的制作4、降温平衡

若采用一次稀释法，可将稀释后的精液用10～12层纱布包裹好，经1～2h缓慢降温至0℃～5℃，然后置于0℃～5℃平衡2～4h，使甘油充分渗入精子内部，起抗冻作用。5、冻结颗粒冻精：用广口保温瓶盛满液氮，用聚乙烯四氟板（或铝板、钢砂网）作为冷冻板固定在液氮面上方1～2cm处，使其温度维持在-80℃～-100℃，然后滴冻。细管冻精：将平衡后的细管精液平铺在纱网上，距液氮面1～2cm处熏蒸5～10min，最后将合格的细管冻精移入液氮罐内保存。也可利用冷冻仪制作细管冻精。任务实施一、准备工作任务三

冷冻精液的制作6、保存：液氮罐7、解冻颗粒冻精：取一消毒小试管，加入lmL解冻液（2.9％柠檬酸钠或其它），水浴加温至38℃～40℃，迅速夹取并投入冻精1粒，轻轻摇荡至完全溶化。解冻后活率不低于0.3。细管冻精：烧杯盛满温水，温度调至38℃～40℃，打开液氮罐，把镊子放至罐口预冷，迅速夹取一支冻精放入烧杯中，轻轻搅拌20s左右。解冻后活率不低于0.35。任务实施一、准备工作任务三

冷冻精液的制作任务四

精液的保存与运输

精液保存的方法，按保存温度不同可分为常温保存、低温保存和冷冻保存三种。对于远距离购买精液的猪场，运输过程至关重要。运输成败的关键在于保温和防震是否做得充分。将精液从甲地运往乙地，应如何运输？任务描述分装：按一次输精量灌装，瓶装容量最高为100mL，袋装（专门精液分装机，用机械分装、封口）容量一般为80mL。注意：封口时尽量排出瓶中空气，贴上标签，标明公猪的品种、耳号、采精日期、保存有效期、生产单位及相应的使用说明。任务实施一、猪精液的保存与运输任务四

精液的保存与运输猪精液自动灌装打印一体机保存：分装好的精液先置于22℃～25℃的室内环境下放置1～2小时，然后移入16℃～18℃的恒温箱中保存。（平放）运输按规定稀释和保存，有详细说明书（站名、公猪品种和编号、日期、稀释倍数、活率和密度等）；包装要严密，多采用精液运输箱或广口保温瓶；避免剧烈震荡和碰撞；保持温度的恒定；防止阳光直射。任务实施一、猪精液的保存与运输任务四

精液的保存与运输保存：液氮罐。使用前要认真检查；填充液氮时要小心谨慎：预冷；及时补充液氮：当液氮消耗掉1/2时，应立即补充；放置在阴凉、通风且干燥的室内，不得暴晒，不可横倒放置；做好定期的清洗和保养工作，每年清洗一次；防冻伤

任务实施二、牛精液的保存与运输任务四

精液的保存与运输运输：液氮罐应加外保护套或装入液氮罐运输箱内。任务实施二、牛精液的保存与运输任务四

精液的保存与运输保存：多采用低温（0℃～5℃）保存，稀释倍数以2～4倍为宜，可按10～20个输精剂量分装。运输：把精液放在盛有冰块的广口保温瓶内，盖好。运输过程中，要注意避光，尽量减少震荡和碰撞。任务实施三、羊精液的保存与运输任务四

精液的保存与运输

背景知识一、精液的组成：精子和精清（附睾、副性腺、输精管分泌物）。成分动物种类

牛羊猪鸡蛋白质（g/100mL）6.85.03.71.2～2.8果糖（mg/100mL）460～60025094山梨醇（mg/100mL）10～14026～1706～80～10肌醇（mg/100mL）25～467～14380～63016～20柠檬酸（mg/100mL）620～806110～2601730甘油磷酰胆碱（mg/100mL）100～5001100～2100110～2400～40钠（mg/100mL）225±13178±11587352钾（mg/100mL）155±689±419761钙（mg/100mL）40±26±2610镁（mg/100mL）8±0.36±0.85～1414氯化物（mg/100mL）174～32086260～430147

“蝌蚪”，家畜50-70um（大鼠190um、大象50um）头部：扁椭圆形、包括顶体和核颈部：脆弱易断尾部：运动器官，分中断、主段、尾段精子形成

背景知识二、精子的形态结构

牛

猪

羊

马

人

小鼠

鸡三、精子的生理特性精子的代谢糖酵解：果糖酵解（在无氧条下，1亿个精子在37℃条件下，在1小时内分解果糖的毫克数称为果糖酵解指数）精子的呼吸：尾部（1亿个精子在37℃下1小时的耗氧量为精子的耗氧率，家畜一般为5～22μL

背景知识精子的运动运动方式：直线运动（有效精子）、转圈运动、原地摆动运动特性：向流性、向触性、向化性

背景知识四、外界因素对精子的影响温度：高温：37～38℃检查活力的最好温区，温度上升，运动剧烈，很快死亡低温：体温降到10℃以下（缓慢），否则“冷休克”—低温冲击，由于突然急剧降温使精子失去活力而不能复苏。超低温：‐196℃、‐79℃（有害温区：0～‐60℃，尤其‐15～‐25℃）光照和辐射：“棕色”渗透压：等渗PH值：牛6.9-7.0、绵羊7.0-7.2、猪7.0-7.5、兔6.8、鸡7.3、人7.4-7.8化学药品：抗生素、磺胺类、甘油、消毒药品（酒精、来苏儿）电解质浓度：稀释：稀释打击

背景知识

五、精液的稀释稀释液的成分及作用稀释剂：扩大容量，等渗，如生理盐水、5％的葡萄糖等。营养剂：提供营养，补充能量，如糖类、卵黄、奶类等。保护剂：缓冲物质：保持精液适当的pH，以防“酸中毒”，如柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和EDTA；非电解质：离子浓度越高，活力越强“早衰”，如糖类、氨基乙酸；防冷物质：“冷休克”，如卵黄、奶类；抗冻物质：缓解有害温区对精子的危害，如甘油、二甲基亚砜（DMSO）抗菌物质：青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素等其它：酶类（ß-淀粉酶）、激素类（OXT）