植物的快繁与脱毒培养课件

第四章植物快速繁殖及脱毒和应用授课人：施和平Email：shihp@1.植物快速繁殖2.脱毒技术及应用2.1.病毒病及其危害2.2脱毒的原理2.3.脱毒苗的鉴定和保存1整体概述概述二点击此处输入相关文本内容概述一点击此处输入相关文本内容概述三点击此处输入相关文本内容2一，植物快速繁殖即应用组织培养技术,快速繁殖名优新品种,使其在较短时间内繁衍较多的植株,快速繁殖珍稀濒危植物,使物种得以保存的技术.3一，植物快速繁殖的途径和方法类型方式特点事例器官型直接以芽增殖繁殖系数高,遗传性稳定甘蔗,香蕉,香石竹等器官发生型脱分化,愈伤再分化繁殖系数高低,用于细胞分化研究烟草,油菜等胚状体发生型从愈伤或外植体直接产生繁殖系数高,胡萝卜,石刁柏等原球茎型外植体产生原球茎遗传性稳定,兰花球茎芽型叶柄-圆球形小突起球茎芽遗传性较稳定,球茎可直接种植观叶海棠.ZZ块茎型叶片形成粒状芋块-芽和根可直接种植花叶芋,马铃薯鳞茎型鳞片形成小鳞茎在试管内形成小鳞茎需较长时间百合,贝母,水仙,郁金香孢子型成熟孢子培养萌发时间长,消毒困难地钱,狼尾蕨根茎型以短根茎为外植体繁殖速度较孢子型快肾蕨等微枝扦插型带芽小插条无菌扦插为木本植物快速繁殖方式葡萄,杨树等41.外植体（不定芽）---出芽（不定芽）（直接再生）贯叶金丝桃不定芽直接再生过程5Shootsdevelopingfromparrotfeatherinternodesectionsculturedfor7daysonmediumwith2-iP.2外植体（茎段）---出芽（不定芽）（直接再生）62.外植体（毛地黄叶片）--愈伤组织—再生植株愈伤组织愈伤组织再生的不定芽75.外植体（叶片等）--原球茎---再生植株（兰科植物）大花蕙兰原球茎增殖与植株再生86.外植体（叶片）-（或愈伤）-体胚---再生植株体细胞胚胎发生98.外植体—孢子—小植株（蕨类植物）10固体培养：液体培养二，培养方式11温室移栽炼苗123.继代培养(Subculture)当初代培养的试管苗在瓶内长到满瓶,或培养基养分利用完时就要转瓶,进行继代培养。驯化现象:植物组织经长期继代培养,发生一些变化,开始继代培养要加入生长调节物质,其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长.这种现象称为“驯化”(acclimation)。例：胡萝卜薄壁组织初代培养要加入10-6mol/LIAA才能达到最大生长量，但继代培养10代以上，则不加IAA照样得到同样的生长量。13继代培养蝴蝶兰，蕙兰等也如此。驯化发生的原因：可能是继代培养中细胞积累了较多的生长物质，因此逐渐减少对外源生长物质的需要。驯化的不足：长期继代，卡德利亚兰只长芽不长根，芽多而细弱。143衰退现象：长期继代培养的组培材料也会逐渐衰退（recession），丧失形态发生能力（生长不良，再生能力和增殖力下降等）衰退现象发生的影响因素：（1）植物材料：不同植物，不同品种，不同器官或不同部位的继代繁殖能力都不相同。通常：草本植物>木本植物，被子植物>裸子植物，年幼材料>老年材料；胚>营养组织，胚>胚状体>愈伤组织（2）培养基和培养条件：培养基和培养条件适当与否对继代培养影响颇大,所以常用改变培养基和培养条件来保持继代培养。石斛兰茎尖或掖芽培养，固体培养基培养形成原球茎后，继代培养要用液体培养基进行振荡培养。15衰退现象（续）（3）继代培养次数：影响因培养材料而异。有些植物长期继代培养仍保持再生能力和繁殖力。有些植物继代增加，变异频率增加，如香蕉不定芽，继代5次为2.14%；10次为4.2%；20次为100%变异。故香蕉继代培养不能超过一年。蝴蝶兰连续培养4年后，植株退化不开花。（4）季节：有些植物材料能否继代培养与季节有关。如水仙鳞茎，六七月份休眠，生长变慢，8月休眠后，生长加快。百合鳞片分化能力：春季>秋>季夏季>冬季16第2节植物快速繁殖的应用1.大量繁殖珍稀或名贵植物如:佛肚兰,卡特丽亚兰等工厂化育苗2.茎尖培养脱毒及脱毒苗的培养无菌苗有毒苗脱毒苗17二，（茎尖培养）脱毒及其应用1.病毒病及其危害2.茎尖培养脱毒的原理3.茎尖培养脱毒的过程4.脱毒苗的鉴定和保存181.病毒病及其危害

脱毒（viruselimination)培养：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中的病毒，生产健康的无毒繁殖材料的过程。191.2.植物病毒病及其危害定义：由植物病毒寄生引起的病害。症状：①变色，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产生花叶、斑点、环斑、脉带和黄化等。花朵的花青素也可因而改变,使花色变成绿色或杂色等,常见的症状为深绿与浅绿相间的花叶症如烟草花叶病。②坏死，在叶片上常呈现坏死斑、坏死环和脉坏死，在茎、果实和根的表面常出现坏死条等。③畸形，器官变形，如茎间缩短，植株矮化，生长点异常分化形成丛枝或丛簇，叶片的局部细胞变形出现疱斑、卷曲、蕨叶及带化等。20番茄厥叶，卷叶病毒正常的番茄果番茄病毒病（植株）1.病毒病的危害及症状21香蕉束顶病俗称虾蕉、葱蕉或蕉公)，病株一般不抽花蕾，因近顶部叶片成束而得名。是由病毒侵染植株而引起的,是香蕉致命病害,蕉农称之为"不治之症"。局部地区蕉园发病率为2%～10%,产量损失30%～60%。221.病毒病及其危害（续）（1）症状:花而不实花叶型马铃薯病毒：退化，叶片卷缩，产量逐年下降，到PVS，PVA，PVM，PVX卷叶型马铃薯病毒：PLRV香蕉束顶病：叶片越来越短小，植株矮缩，叶硬直成束（毁灭性病害）.不结果或果特心,异常柑桔黄龙病:苹果花叶病毒，番茄病毒病，葱类黄矮病，菊花斑萎病，兰花叶病，白合丛生病。黄瓜病毒病231.3病毒病对观花植物的危害(续)正常植株:花朵大而艳花序的花数目多植株健壮地下繁殖器官多而饱满带毒植株花朵小而色衰(如菊花等)花序的花朵数少得多(如大花蕙兰)植株矮小地下繁殖器官少而小(如大丽菊等)花而不实241.病毒病的危害（续）目前受病毒危害严重影响生产的有：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、黄瓜、辣椒。果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。花卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等25危害园艺植物的病毒数目植物种类染病毒种类植物种类染病毒种类植物种类染病毒种类菊花19矮牵牛5葡萄26康乃馨11马铃薯17樱桃44水仙4大蒜24无花果5唐菖蒲5豌豆15桃23风信子3百合6梨11月季10柑橘23草莓24天竺葵5苹果36261.4有关病毒病的研究历史1934,white（美）观察烟草根系，发现：病毒在根，茎的分布不均匀。离根尖和茎尖越近，病毒的密度越低，反之，越高。分生组织一般无病毒，病毒在生长旺盛的部位繁殖速度慢.1952，Morel（法）和martin，首先利用茎尖分生组织脱毒了无病毒苗，建立茎尖脱毒组培体系272、茎尖脱毒的原理基本原理：利用病毒在植物组织中分布的不均匀性（分生组织无病毒）而茎尖培养脱毒的可能原因（1-5）：1，旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，使病毒无法进行复制28

2。传导抑制：（1）病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。（2）通过胞间联丝（但茎尖无胞间联丝）。

3.激素抑制，在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，可以抑制病毒增殖，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。酶缺乏，1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。

抑制因子，1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子29

3.茎尖培养脱毒的过程

一，脱毒前的准备工作：1.被脱毒植物携带病毒的诊断根据植物病毒病的症状特征和表现程度判断病毒类型及感染程度。

2.母体植株的选择和预处理母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择;无损伤。

30一，脱毒前的准备工作（续）3.材料的预处理：一般采用热处理方法香石竹在38～40℃条件下经两个月处理可除去全部病毒。菊花在35～38℃条件下处理60天可使病毒失活。

大田材料:定期喷内吸杀菌剂如0.1%多菌灵和0.1%链霉素)处理.312.茎尖剥离(常规消毒后,在双筒体式解剖镜下操作)脱毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点（茎尖）大小的相关性，这样在取材时就方便多了茎尖越小对培养基的要求越高，剥离技术要求越高，成功率越低32表2离体茎尖长度对马铃薯脱毒的影响茎尖长度/cm叶原基数发育成小植株数无病毒再生植株0.120.2712504224180.604640

33表3.带病毒植株脱除病毒时宜采用的茎尖大小植物种类病毒种类茎尖长度/mm品种数马铃薯马铃薯Y病毒马铃薯X病毒马铃薯卷叶病毒马铃薯G病毒马铃薯S病毒1.0-3.00.2-0.51.0-3.00.2-0.3<0.217315甘薯斑叶花叶病毒缩叶花叶病毒羽毛状花叶病毒1.0-2.01.0-2.00.3-1.0612甘蔗花叶病毒0.7-0.81大丽花花叶病毒0.6-1.01343.茎尖培养脱毒的过程（续）3.茎尖培养:MS培养基;怀特培养基等（高盐培养基）,.添加5-1-%椰乳;0.1-1.0毫克/升IAA,NAA或者说-BA,活性碳等.4.提高脱毒效果的方法:高温处理,低温处理,化学处理(加入嘧定,或嫖呤的类似物,氨基酸,抗生素处理,三氮唑核苷)5.脱毒苗的鉴定:355.脱毒效果检测一般来说，再生植株后，在18个月以内进行病毒鉴定，因为病毒在植物体内的潜伏期为6-12个月以上。36茎尖脱毒培养注意事项（要考）:

1，茎尖越小,带有病毒的可能性就越小,但太小又不易成活.2，茎尖培养的成活率与所取的茎尖大小成正比；茎尖培养的脱毒效果与所取的茎尖大小成反比.3.培养基中尽量不用2,4-D(变异)4.茎尖培养还可除去其它病原体,如细菌,真菌等.374.脱毒苗的鉴定和保存并非所获得的无菌苗均为无毒苗,如生长点培养的无毒苗成苗率和脱毒率都非常低,所获品种在用作无毒苗原种之前均需进行病毒鉴定,方法如下:(1).直接测定法(2)指示植物法:3.ELISA4.分子生物学方法等。38抗血清反应鉴定ISEM4、脱毒植物的鉴定和保存指示植物鉴定直观鉴定39指示植物(testplants)鉴定——利用病毒在其他植物上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种专用以产生症状的（寄主）植物就是指示植物。寄主植物能够辨别某种病毒的专化性症状。方法：将待测植物的汁液接种到指示植物，如果待测植株带毒，则指示植物上会出现特定症状。常用的指示植物有:千日红(Gomphrena

globosa);苋色藜(Chenopodium

amaranticolor)和各种烟草.由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。四、脱毒植物的鉴定方法（续）40血清鉴定(serologicaltest)(抗原抗体反应)：病毒抗血清具有高度的专化性，因而可用于鉴定受感染而没有症状的带毒植物。试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。

植物汁液抗血清对照血清四、脱毒植物的鉴定方法（续）414.2.脱毒后防病毒再感染1.无病毒苗的隔离保存:(1)防止昆虫传播病毒;(2)严防土壤传播病毒2.无病毒苗的保存