免疫组化技术-免疫酶组织化学技术（病理检验技术课件）

病理检验技术

免疫组化技术

免疫酶组织化学技术概述免疫酶组织化学技术

概述

临床病理诊断中应用的免疫组织化学技术主要是免疫酶组织化学技术,首先用或荧光素标记特异性第一抗体(一抗)或连接抗体(二抗或三抗),然后使这些抗体与组织细胞中相应的抗原或抗原抗体结合物结合,再通过酶参与显色剂的化学反应或激发荧光素而使抗原-抗体结合物呈色,在显微镜下可观察到这些呈色,从而能在组织切片或细胞涂片中检测组织细胞内相应的抗原。免疫酶组织化学技术—概述

一、抗体标记酶及其性质免疫酶组织化学技术中酶标抗体就是将特定的酶与抗体稳定的结合,酶标记的抗体有特异性第一抗体,更多的是标记第二抗体或第三抗体。理论上选择标记抗体的酶时应考虑组织细胞中最好不存在相同或同类型的内源性酶,但实际中并非如此,这需要在免疫组化染色中采取一些措施避免这些内源性酶的干扰。免疫酶组织化学技术—概述

用于标记抗体的酶有很多,一般要符合以下要求:1.分子量不大,容易获得,是商品化的试剂。2.能够与抗体牢固结合,结合后不容易解离,而且与抗体结合后不会抑制抗体的活性。3.催化的底物是容易获得和保存的试剂。4.催化底物发生反应所形成的反应物必须具有一定的颜色,该颜色越鲜艳、越深越好，容易被观察到；反应物要稳定,不容易褪色或被染色所显示出来的物质要具有稳定性,尽可能不被制片过程中所用的化学试剂和封片剂等溶解,不会在反应部位向周围扩散。

免疫酶组织化学技术—概述

二、常用的抗体标记酶

1.辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)属于过氧化物酶类的酶,来源于深根性植物辣根。由于辣根过氧化物酶存在于植物,具有活性高、分子量小、稳定和纯酶容制备出高纯度酶的特点,所以在免疫组化技术中最常用于标记抗体。但是辣根过氧化物酶和存在于人体和动物的其他过氧化物酶一样具有相同催化某些化学反应的性质,而且这些过氧化物酶能耐受甲醛固定、乙醇和二甲苯以及石蜡的浸泡,在石蜡切片中酶的活性依然很高。免疫酶组织化学技术—概述

二、常用的抗体标记酶

1.辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)因此,辣根过氧化物酶的催化反应会受到人体或动物中存在的内源性过氧化物酶的干扰。内源性过氧化物酶主要存在于血细胞、甲状腺、乳腺和唾液腺等。氰化物可抑制过氧化物酶的活性。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物。免疫酶组织化学技术—概述

二、常用的抗体标记酶

2.碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP,ALP,AP)属于水解酶类的酶,容易分离纯化稳定。在免疫组化技术中常用于标记抗体。广泛存在于人体和动物的组织中,常见于具有活跃运转功能的细胞中,如毛细血管内皮、肝、骨骼、肾皮质和肾上腺等。免疫酶组织化学技术—概述

二、常用的抗体标记酶

2.碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP,ALP,AP)因此,碱性磷酸酶的催化反应会受到人体或动物中存在的内源性碱性磷酸酶的干扰。在石蜡切片制片过程中,受各种因素影响,酶将部分或全部失去活性。氰化物、砷酸盐、左旋咪唑等可作为碱性磷酸酶的抑制剂。免疫酶组织化学技术—概述

辣根过氧化物酶HRP碱性磷酸酶AP常用的抗体标记酶病理检验技术

免疫组化技术

免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术操作准备免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术操作准备免疫酶组织化学技术染色操作与常规的制片技术有许多相同之处,但在操作上也有其特殊性。免疫组化染色操作包括组织切片制备的各个环节都会成为影响免疫组化染色结果的因素。这些环节不管哪一个出现失误都会影响染色结果的准确性,从而可能影响病理诊断的准确性。因此,在免疫组化技术中作好前期准备工作,并进行规范操作和质量控制极其重要。

免疫酶组织化学技术操作准备—步骤一、检测标本选择二、组织固定三、组织石蜡切片制备四、载玻片处理五、组织切片六、缓冲液的应用七、抗原修复八、内源性酶消除九、内源性生物素消除十、内源性色素消除免疫酶组织化学技术操作准备—步骤十一、实验对照设立十二、血清封闭十三、抗体使用十四、显色与显色剂十五、背景复染与复染试剂十六、封片与封片剂十七、染色结果的观察免疫酶组织化学技术操作准备—显色机制1.辣根过氧化物酶是一种过氧化物酶，能催化多种物质被过氧化氢氧化。DAB的显色反应是在HRP的催化下,H2O2将DAB氧化成还原型的DAB,还原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀(图4-1)。免疫酶组织化学技术操作准备—显色机制2.碱性磷酸酶是一种水解酶,可催化水解萘酚磷酸酯释放出萘酚和重氮盐偶联而显色。固蓝/固红的显色反应是在AP的催化下,萘酚AS-MX磷酸酯被水解为萘酚,萘酚和固蓝/固红起偶联反应,在AP的活性部位形成蓝色/红色的不溶性沉淀(图4-2)。免疫酶组织化学技术操作准备—显色机制选用不同的显色剂需要配套使用不同的酶标抗体检测试剂盒,不同的显色剂可呈不同的颜色(表4-1)。免疫组化检测试剂盒标识是LSAB/HRP/Rabbit,表示LSAB法，抗体标记酶是辣根过氧化物酶，二抗为兔免疫球蛋白，用于检测兔单抗或兔多抗的第一抗体；EnVision/AP/Mouse则表示EnVision法，抗体标记酶是碱性磷酸酶，二抗为鼠免疫球蛋白，用于检测鼠单抗的第一抗体。免疫酶组织化学技术操作准备—显色机制合理选用酶标抗体检测系统和显色剂，可进行多重免疫组化染色,在同一切片上清晰地显示组织细胞中多种抗原呈多种不同颜色的表达。如图4-3示DAB显色,结果呈棕色；如图4-4示AEC和固蓝显色,结果分别为红色和蓝色；如图4-5示DAB、固蓝和固红显色结果分别为棕色、蓝色和红色。病理检验技术

免疫组化技术

免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学染色方法及操作免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学染色方法及操作

免疫组化染色方法有多种,临床病理诊断要求使用敏感性高和特异性强的免疫组化技术方法。近年来,由于抗体制备技术不断地改进和提高,不同公司生产的检测试剂盒,在特异性和敏感性方面各有特点,各实验室可以根据自己的实际情况,合理选用。

免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术---方法

（一）EnVision法1.特点EnVision法为采用聚合物技术的二步法,是非生物素检测系统,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭,具有敏感性高,操作简便和非特异性染色少的优点,已成为最常用的方法之一(图49)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒只

有EnVision/HRP/抗鼠/抗兔二抗工作液。不同编号的试剂盒有所不同，有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择EnVision/AP/抗鼠/抗兔二抗。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗,孵育10~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(9)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钅钟,蒸馏水洗5~10分钟。(10)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法LSAB(S-P)法1.特点LSAB法采用链菌抗生物素蛋白-生物素技术,其中链菌抗生物素蛋白与生物素具有很强的亲和力,三步法染色,加入的二抗和三抗可将抗原-抗体结合物不断放大,敏感性较高。高纯化的抗体技术,使背景更加清晰。为含生物素检测系统,需注意封闭内源性生物素。二抗含有抗鼠、抗兔和抗羊免疫球蛋白,适用于与鼠抗、兔抗和羊抗等一抗配套使用。价格较便宜(图4-10)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

包含生物素标记的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白(biotin-mouse/rabbit/goatlgG)工作液,标记HRP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/HRP)工作液。不同编号的试剂盒有所不同,有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择标记AP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/AP)。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)正常血清封闭后直接滴加一抗工作液,孵育30~60分钟:或孵育过夜(约16小时)。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加鼠/兔/羊二抗,孵育20~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)滴加链菌抗生物素蛋白/HRP(三抗),孵育20~30分钟,37℃。(9)PBS洗5分钟,3次。(10)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(11)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(12)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法(三)EPOs法1.特点EPOS法采用聚合物技术的一步法,敏感性高。一抗不含生物素,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭。最大的优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色。缺点是抗体种类不多,一抗只有标记HRP(图4-11)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

不用检测试剂盒,只需要选用EPOS一抗即可。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育45分钟,37℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(7)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(8)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---质量控制1.组织离体后应及时固定,最理想的固定液为10%的中性缓冲甲醛液(pH7.2~7.4)固定时间为4~6小时,不超过24小时。固定不足或过度固定都不利于免疫组化染色。2.石蜡切片脱蜡要彻底,脱蜡不干净会造成局灶性阳性等染色不均匀的现象,甚至染色失败。3.是否进行抗原修复,可参考一抗说明书或实验室预实验结果来定。许多抗原检测进行抗原修复时,可以用热处理方法替代蛋白酶消化方法。不当的抗原修复会导致抗原定位发生改变,即应该细胞质阳性的则出现细胞核阳性等；也会引起假阳性或假阴性的结果。4.使用的二抗为HRP/鼠/兔,不需要考虑所用的一抗是鼠抗还是兔抗。5.在临床病理学诊断时,是否需要行免疫组化染色作为辅助诊断,如需要,选用多少种抗体,用哪一种抗体和哪一种克隆的抗体由诊断医师来决定。但技术员应了解和记录同种抗体中染色效果最好的厂牌和批号,每次使用新批次的抗体,都应该先做预实验来检测抗体的效价。如果更换不同类型的检测试剂盒,因敏感性不同,一抗的稀释度或一抗的孵育时间有可能不同,即使是即用型一抗都有可能需要稀释。一抗稀释度越大,背景染色越少,所以应选用较敏感的检测试剂盒,以提高一抗的稀释度。6.不同试剂盒标记的酶可能不同,应合理选用，与一抗和显色剂的配套使用。在HRP系统,可用AEC代替DAB显色,阳性结果呈深浅不一的红色。在AP系统可选用固蓝或固红显色剂,阳性结果呈深浅不一的蓝色或红色。除DAB显色外,用其他显色剂显色后,都不能用乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封片,只能用水溶性胶封片,而且不能长时间保存切片。除非行双重染色,一般应首选DAB为显色剂(表4-3)。免疫酶组织化学技术---质量控制免疫酶组织化学技术---质量控制7.手工染色时,抗体孵育切片应在37℃进行,使每次染色抗体孵育都能在恒定的温度下进行,不受室温的影响。在低温如4℃进行第一抗体孵育切片,时间可以延长至16~24小时,通常是过夜,更有利于与抗原抗体充分结合。8.滴加抗体要完全覆盖组织。在加抗体前用含0.05%吐温的PBS浸洗切片,可有效避免由于抗体表面张力的作用,在组织表面隆起而引起组织边缘出现假阳性的现象。9.加抗体前后均应用PBS充分浸洗切片,不必担心过多浸洗使抗原-