微生物检验常用技术与方法-临床真菌检验技术与方法（微生物检验课件）

临床真菌检验技术与方法掌握真菌的检验方法。

熟悉真菌标本采集及注意事项；熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物

敏感试验方法。第一节

真菌形态检验技术一、标本的采集和处理

1.标本的采集——根据真菌感染部位采集不同的标本。取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本深部真菌感染浅部真菌感染标本来源要适宜用药前采集标本严格无菌操作标本量要充足立即送检2.标本采集注意事项第一节

真菌形态检验技术第一节

真菌形态检验技术临床标本分离培养直接检查免疫学检查观察菌落生化反应染色镜检直接镜检3.检验程序核酸检测其他鉴定试验形态学检查病理组织标本动物实验镜检PASHE第一节

真菌形态检验技术二、直接镜检

标本处理液：（1）KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料。（2）生理盐水：用于观察真菌的出芽现象。（3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力较强，只限于不透明的标本。镜检（加温）毛发或皮屑等注意真菌与其他混杂物的鉴别标本+标本处理液第一节

真菌形态检验技术三、染色镜检革兰染色：各种真菌均为革兰阳性。（图1）乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色。（图2）墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色。（图3）荧光染色：荧光显微镜下发出荧光。糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色。返回章内容（图1）（图3）（图2）第二节

真菌培养技术一、基本条件1.常用工具平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等。第二节

真菌培养技术一、基本条件2.

培养基真菌营养要求不高，最适pH4.0～6.0。常用的培养基：培养基名称培养基用途沙氏培养基真菌的常规培养放线菌酮-氯霉素琼脂真菌的常规培养玉米粉吐温-80琼脂观察白假丝酵母菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂

观察真菌菌落色素，用于鉴别尿素琼脂生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）心脑浸液葡萄糖血琼脂显色鉴定培养基深部真菌培养真菌的培养与鉴定第二节

真菌培养技术白色念珠菌：热带念珠菌：克柔念珠菌：光滑念珠菌：近平滑念珠菌：蓝绿色蓝灰色、铁蓝色粉红色紫色白色

显色鉴定培养基真菌特异性酶的底物（无色）产色基团代谢基质产色基团游离（显色）真菌的酶分解代谢基质原理第二节

真菌培养技术二、培养方法仅用于培养生长繁殖较快的真菌。观察真菌结构及生长发育过程。多用于菌种传代接种与保存。试管培养法大培养法小培养法玻璃棒载玻片培养基盖玻片无菌蒸馏水第二节

真菌培养技术三、生长现象

类酵母型菌落丝状菌落观察菌落生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等。酵母型菌落返回章内容糖（醇）类发酵试验检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵情况。同化碳源试验检测真菌对糖类中的碳源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌。同化氮源试验检测真菌对氮源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌。明胶液化试验某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋白，使其失去凝胶性质而不能凝固。尿素分解试验某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。一、常用生化试验第三节真菌的鉴定方法二、免疫学检查第三节真菌的鉴定方法皮肤试验提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试验，观察注射或试验部位有无红肿硬结出现。血清学检测检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、放射免疫分析等。第三节真菌的鉴定方法三、其它鉴定诊断方法l.厚膜孢子形成试验接种玉米粉吐温-80琼脂

25℃孵育1~3天待测菌每天于显微镜下观察应用：白假丝酵母菌的鉴定。方法：结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假

菌丝顶端见1~2个厚膜孢子。厚膜孢子假菌丝2.芽管形成试验

方法：待测菌+0.5~1ml血清37℃水浴2~3小时镜检应用：白假丝酵母菌的鉴定。第三节真菌的鉴定方法三、其它鉴定诊断方法结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管。芽管第三节真菌的鉴定方法三、其它鉴定诊断方法

3.动物接种4.病理组织检查5.核酸检测6.真菌毒素的检测用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究抗真菌药物。用于深部真菌感染的诊断。用于真菌的分型鉴定。有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法等多种方法。7.G试验用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。返回章内容第四节真菌检验G试验、GM试验应用背景侵袭性真菌病临床表现不典型，确诊通常需要侵入性的组织标本，因此有较高的漏诊率。目前国内大多数医院都在开展非侵袭性实验室技术如G试验和GM试验，成为真菌感染的诊断标准之一，以提高真菌感染的阳性率。第四节真菌G试验、GM试验定义G试验又称1,3-β-D葡聚糖试验，检测的是真菌的细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液及体液中含量增高。1,3-β-D葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物