病毒检验技术-病毒的其他鉴定技术（微生物检验课件）

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病毒鉴定的方法

1、病毒增殖后导致细胞形态变化:①细胞病变效应(CPE)：细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑。2②多核巨细胞和包涵体。

细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；

2.红细胞吸附：血凝现象。

3.细胞培养液pH的变化。34.病毒的数量与感染性测定

(1)空斑或蚀斑形成试验

空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。4蚀斑（plaque）测定蚀斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）病毒的数量与病毒毒力测定。(2)50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定

：用来估计病毒感染的强弱程度。54.其他实验

(1)干扰现象:

某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。6(2)耐酸试验

肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

(3)乙醚敏感试验病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。7

一、血清学诊断方法

（一）抗原的检测：

病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。病毒血清学诊断及其他快速诊断方法81．免疫荧光技术适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。92．酶免疫技术

有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。103.其他技术

如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。11●标本采集时间、急性期单份血清IgM、双份血清IgG●常用血清试验原理和用途

1、中和试验

（二）抗体检测

2、补体结合试验3、血凝及血凝抑制试验4、免疫荧光试验5、酶联免疫吸附试验6、免疫印迹实验7、固相免疫放射测定12早期抗体检测

检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAV的IgM抗体可以明确诊断HAV等。13

二、病毒的分子生物学检测方法

只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。14（一）核酸分子杂交技术：1．斑点杂交法

将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射自显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。152.原位分子杂交技术

在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。16

3.Southern印迹和Northern印迹法

Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA特异序列。

Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。17

（二）聚合酶链反应(PCR)

选择病毒的特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。(1)DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。(2)RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。18(3)定量PCR技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。19（三）基因芯片技术将数以万计、乃至百万计