RT-qPCR(实时荧光定量PCR)课件

实时荧光定量PCR技术

RealTimeQuantitativePCR南开大学医学院lfnn实时荧光定量PCR技术

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RT-qPCR原理Contents1

RT-qPCR步骤2

SYBR实验步骤3LogoRT-qPCR原理Contents1RT-qP2LogoRT-qPCR原理1定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。1.荧光原理：SYBRGreen2.定量原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值（2）定量原理：

绝对定量（标准曲线）、相对定量（2-ΔΔCt）

（3）融解曲线LogoRT-qPCR原理1定义：在PCR反应体系中加入荧3非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

结合于双链DNA小沟之间，只有和双链DNA结合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）RT-qPCR原理---荧光原理非特异性荧光标记：RT-qPCR原理---荧光原理4特异性荧光标记：

1、TaqMan

水解型杂交探针。5′端标记有报告基团R，3′端标记有荧光淬灭基团Q。探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针R与Q分开，发出荧光。

2、MolecularBeacon

分子信标。标记荧光的发夹探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。

3、Amplisensor

双链信号引物，进行半巢式扩增；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，产物量与荧光成反比。QQR特异性荧光标记：QQR5LogoRT-qPCR原理----定量原理1扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1扩增曲线图：C6LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：

扩增反应的循环次数X：

第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率

logX0=-log(1+Ex)*Ct+log

X

Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量.1.绝对定量LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反7LogoRT-qPCR原理----绝对定量1模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量1.绝对定量LogoRT-qPCR原理----绝对定量1模板DNA8LogoRT-qPCR原理----绝对定量1R2为相关系数：R2>0.99时，认为两数值之间相关性好。E为扩增效率：一般认为在90%-110%之间数据可用。LogoRT-qPCR原理----绝对定量1R2为相关系数9LogoRT-qPCR原理----相对定量12.相对定量结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。LogoRT-qPCR原理----相对定量12.相对定量结10RT-qPCR原理----融解曲线温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线为单一峰，无非特异性荧光，定量准确。溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。RT-qPCR原理----融解曲线温度荧光强度TmTm值：11RT-qPCR步骤----SYBRGreen法1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、Realplex软件2.将样本等稍许离心3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）

反应体系：ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL样本1μL4.将八连管标记后离心至无壁挂液体5.将其置入Realplex仪中，

设置程序：95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循环，END后右键设置“insert---meltingcurve”，后绿色运行6、反应结束后将数据导出，分析数据。RT-qPCR步骤----SYBRGreen法1.准备物12反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同RT-qPCR步骤----SYBRGreen法反应体系的建立及优化:RT-qPCR步骤----SYBR13对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便