生物制药第四章-多肽与蛋白质药物教学课件

（一）材料选择原料来源包括动物、植物及微生物等。选择原料时应考虑来源丰富、目的物含量高、成本低且易于提取的材料。同时应考虑其种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞等因素的影响。（二）蛋白质提纯的一般方法1．根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质。2．根据蛋白质分子形状和大小不同来纯化蛋白质。3．根据溶解度的不同来纯化蛋白质。4．根据电离性质的不同来纯化蛋白质。5．根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。（二）蛋白质提纯的一般方法（二）蛋白质提纯的一般方法对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂，主要是取其具有较大的蛋白质吸附容量，较高的流速和分辨率等优点。另外电泳法亦是利用电离性质的不同来分离纯化蛋白质。

（二）蛋白质提纯的一般方法6．根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质。7．根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质8．根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。9．根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质。10．根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质。（三）蛋白质的分离和纯化1．时间因素在蛋白质分离和纯化过程中，共同的问题是蛋白质反应达到平衡所需要的时间，而且为避免蛋白质的变性、微生物的污染等，操作常在低温环境中进行。通常在25℃时，化学反应的速率是低温5℃时的3-4倍。2．选择离子交换层析条件的程序（三）蛋白质的分离和纯化3.蛋白质分离纯化的可能的技术手段的组合（三）蛋白质的分离和纯化分步分离纯化的可能步骤（四）溶液中蛋白质浓度的测定1.UV法（1）280nm光吸收法（2）280nm和260nm的吸收差法（3）215nm和225nm的吸收差法2.双缩脲法3.福林一酚试剂法4.考马斯亮蓝G-250染色法

（五）纯度检查确定protein的纯度标准一般为：分子大小是否均一，电荷是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N端和C端残基，能否结晶，进一步纯化时生物活性是否有所提高等。（五）纯度检查常用蛋白质纯度检查的方法有：1．HPLC或FPLC2．电泳均一性3．免疫化学法4．生物测定法（五）纯度检查5．分光光度法（1）UV法（2）IR法6．高速离心法7．可结晶性8．N端，C端的测定9．恒定的氨基酸比多肽类

概述由氨基酸缩合而成的化合物称为多肽，它们是通过一个氨基酸分子的-NH与另一分子氨基酸的-COOH脱去一分子水形成-CO-NH-键而相互连接起来的。概述一般将50或50个以下的氨基酸残基组成的化合物，列入多肽。多数无特定空间构象，某些多肽也有一定构象，但其构象的坚固性远不如蛋白质，其构象的浮动性很大。多肽在生物体内的浓度很低，在血液中一般为,但它们的生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。概述活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的。1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素（OT）。到了60、70年代神经肽的研究进入高潮。同时，由于很多脑活性肽也存在于胃肠道组织中，从而推动了胃肠道激素的研究.到了70年代，生物技术的发展更开拓了多肽药物的新领域——细胞生长调节因子。现已发现的细胞生长调节因子已近100种.概述许多活性蛋白质，多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的。它们中间许多有共同的来源，相似的结构，甚至还保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系,将有助于设计和研制新的活性多肽药物。临床上有一些确有疗效的组织提取制剂其有效成分有的还不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效主要多肽类药物1．多肽激素①垂体多肽激素：促皮质素（ACTH），促黑激素（MSH）②下丘脑激素：促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF）③甲状腺激素：甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。④胰岛激素：胰高血糖素，胰解痉多肽。⑤胃肠胃道激素：胃泌素，胆囊收缩素一促胰激素（CCK-PZ）⑥胸腺激素：胸腺素、胸腺肽主要多肽类药物2．多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。3．含有多肽成分的其他生化药物骨宁、血活素等。主要多肽类药物制备（一）胸腺激素（二）促皮质素（ACTH）（三）降钙素（一）胸腺激素胸腺是一个激素分泌器官。对免疫功能有多方面的影响。胸腺位于纵隔腔上部，胸骨后方.胸腺发生于胚胎第二个月。到出生二年内，生长迅速，体积较大，到青春期仍继续发育，青春期后发生萎缩。因此胸腺原料必须采自幼龄动物（一）胸腺激素胸腺依赖性的淋巴细胞群——T细胞直接参与有关免疫反应T细胞主司细胞免疫（机体在特异抗原的刺激下，以T细胞为主产生致敏淋巴细胞的免疫反应称细胞免疫）。主要胸腺激素制剂名称化学性质胸腺素组分5一族酸性多肽，MW1000～15000猪胸腺素注射液多肽混合物，MW15000以下胸腺素a1具有28个氨基酸残基的多肽，MW5562，pI4.2胸腺体液因子多肽，MW3200，pI5.7血清胸腺因子9肽，MW857，pI7.5胸腺生成素具有49个氨基酸残基的多肽，MW5562，pI5.7胸腺因子X多肽，MW4200胸腺刺激素多肽混合物自身稳定胸腺激素糖肽，MW1800～2500注：MW＝分子量；pI＝等电点（一）胸腺激素－胸腺素以胸腺为原料，按一定方法提取纯化胸腺的第五种组分。组分5，在80℃热稳定的由40～50种多肽组成的混合物，MW为1.000～15.000。pI3.5～9.5。分三个区域：α区，β区，γ区。其中，主要活性组分为α1、α5、α7、β3、β4等。（一）胸腺激素－胸腺素主要生物学功能表现在：连续诱导T细胞分化发育的各个阶段，放大并增强成熟T细胞对抗原或其他刺激物的反应，维持机体的免疫平衡状态（一）胸腺激素－胸腺素工艺路线（一）胸腺激素－胸腺素检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%。分子量15.000以下。（T细胞与绵羊红细胞产生E-玫瑰花结）。作用与用途：免疫调节剂

临床用于免疫缺陷病、自身免疫病、变态反应性疾病、细胞免疫功能减退的中老年人疾病、抗衰老、抗肿瘤的治疗。（一）胸腺激素－胸腺肽是从幼年动物的胸腺中提取制备的一种具高活力的混合肽类药物制剂。MW是9.600和7.000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸的组成达15种，必需氨基酸含量高，还含有RNA、DNA、对热较稳定，加温80℃生物活性不降低。经蛋白水解酶作用，生物活性消失（一）胸腺激素－胸腺肽工艺路线（一）胸腺激素－胸腺肽检验方法：活力测定同胸腺素。分子量10.000以下。作用与用途：调节细胞免疫功能，有较好的抗衰老和抗病毒作用。适用于原发性和继发性免疫缺陷病以及因免疫功能失调引起的疾病。对肿瘤有良好的辅助治疗作用。也用于贫血、肝炎等。无过敏反应和不良的副作用。蛋白类

概述（一）蛋白类药物的分类（二）蛋白类药物作用方式（三）应用基因工程技术制备重要的蛋白类药物（四）蛋白质工程技术的应用（一）蛋白类药物的分类1．蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素（2）促性腺激素（3）胰岛素及其他蛋白质激素2．血浆蛋白质

如白蛋白，免疫丙种球蛋白。3．蛋白质类细胞生长调节因子

干扰素α、β、γ，FL（一）蛋白类药物的分类4．粘蛋白

如胃膜素等。5．胶原蛋白如明胶，阿胶。

明胶：牛、羊的皮、骨、肌腱中所含的骨胶原，经水煮并蒸发浓缩而得到的干燥蛋白质。治疗吐血、内脏出血，也用于胶囊、肠衣、栓剂的基质。阿胶：驴皮去毛后加水熬制而成的胶块。滋肾补血，止血。（一）蛋白类药物的分类6．碱性蛋白质

硫酸鱼精蛋白，存在于鱼类成熟的精子中，强碱性。7．蛋白酶抑制剂

如胰蛋白酶抑制剂，亦称抑肽酶。8．植物凝集素

PHA、ConA。（二）蛋白类药物作用方式已从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制物等多种领域（三）应用基因工程技术制备重要的蛋白类药物已实现产品工业化的有几十种，并正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物的表达。（四）蛋白质工程技术的应用鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定抗原性，容易失活，体内半衰期短，用药途径受限制等缺点。应用蛋白质工程技术对其进行结构修饰，设计小分子代替大分子，并增强或增加其选择性疗效。主要蛋白质类药物的制备（一）白蛋白（二）胰岛素（Insulin）（一）白蛋白白蛋白又称清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，约占总蛋白的55%，由575个氨基酸组成，单链，可溶于水，MW65000、PI4.7。加入NaCl能提高其热稳定性。（一）白蛋白血液的组成从健康人的血管内抽一些血放到试管里，并加上一些抗凝物质（如枸橼酸钠），从而使血液保持液体状态。静置一段时间后可发现试管内的血液分成两部分，上面是浅黄色透明的液体，称为血浆。下面为血细胞，大部分是红细胞。在红细胞表面有一薄层白细胞和血小板，因此，血液就是血浆和血细胞两部分组成的。血浆中绝大部分是水，此外还含有：蛋白质、葡萄糖、无机盐和代谢终产物等多种物质。（一）白蛋白-工艺路线（一）白蛋白白蛋白的两种制品：

人血清白蛋白（从健康人血浆中分离的）。

胎盘血白蛋白（从健康产妇胎盘中分离的）。制剂状态：淡黄色略粘稠的澄明液体或白色疏松状（冻干）固体。作用与用途：维持血浆胶体渗透压，用于失血性休克，严重烧伤，低蛋白血症等的治疗。（二）胰岛素（Insulin）1922年从胰脏中提取得到Insulin。1923年开始供应临床使用。1955年首次报道了胰岛素的氨基酸序列；我国在1965年在世界上首先成功完成牛结晶胰岛素的全合成工作；1969年确定了胰岛素的三维结构；1979年克隆了胰岛素基因；1982年胰岛素被批准上市，成为第一个投放市场的基因工程药物（二）胰岛素（Insulin）糖尿病：胰岛素分泌不足或作用障碍，致使血糖升高，肾脏不能将肾小球滤液中的葡萄糖重吸收回血，出现尿糖增加，并伴随多尿，引起多饮多食，体重减少。胰岛中的胰岛素原经过酶水解产生胰岛素，进入血液循环。（二）胰岛素（Insulin）胰岛素原是由一条连接肽（C肽）一端与胰岛素的A链的N端相连，另一端与B端相连。胰岛素由51个氨基酸组成。有A、B两链，（A链21个、B链30个），两链由两个二硫键相连。（二）胰岛素（Insulin）人体分泌胰岛素过程（二）胰岛素（Insulin）胰岛素立体结构图（二）胰岛素（Insulin）不同种属动物的胰岛素，主要差别在A链的第8-10位氨基酸及B链的第30位氨基酸（C末端上）（二）胰岛素（Insulin）－性质胰岛素为白色或类白色的扁斜形六面体结晶粉末难溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液，也易溶于80%以下的乙醇或丙酮。在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶。在高浓度锌的solu中pH6～8时胰岛素溶解度急剧下降pI5.30-5.35分子量5000多易与Zn2+,Cd2+,Co2+

等2价金属离子结合。在锌盐存在下，胰岛素的pI可增至6.0左右。（二）胰岛素（Insulin）－性质胰岛素在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。在水溶液中胰岛素分子受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象。胰岛素可被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等水解，不能口服，只能注射。在血液及组织中也能被蛋白酶水解，因此在体内失效很快，半衰期很短。药用胰岛素常制成锌胰岛素，也可制成鱼精蛋白胰岛素。（二）胰岛素（Insulin）－工艺路线（二）胰岛素（Insulin）－说明与讨论（1）胰脏质量是胰岛素生产中的关键。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，要立即深冻。胰尾部分含胰岛素含量较高。并贮存不宜过久。（二）胰岛素（Insulin）－说明与讨论（2）第一次提取用86%乙醇，与胰糜混合后，其最终百分浓度为70%左右，不仅能完全溶解胰岛素，而且能抑制蛋白水解酶的活力。（3）草酸是弱酸，较温和，控制pH在2.5,不仅胰岛素较稳定，还能抑制蛋白水解酶的活力。（4）提取温度控制在10-15℃

，因为温度偏高会增强酶对胰岛素的破坏作用，会使油脂含量增加，影响分离工序。（二）胰岛素（Insulin）－说明与讨论（5）碱化时pH控制在8.2-8.4，pH低了除碱性蛋白不完全，