质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散的影响,生物化学论文

质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散的影响,生物化学论文双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定DNA重组成功与否的重要方式方法[1],琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作[2],而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6-磷酸脱氢酶〔glucose6-phosphatedehydro-genase,G6PD〕重组质粒pET-28a-G6PD时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响，现报道如下，以供参考。1材料与方式方法1.1质粒与菌株含空质粒pET-28a的大肠杆菌Top10〔pET-28a/Top10〕由本教研室保存。重组质粒pET-28a-G6PD为笔者构建并转化至Top10感受态细胞中。1.2试剂与仪器质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、50TAE电泳缓冲液购自上海生工生物工程有限公司，快速限制性核酸内切酶为Fermentas公司产品，琼脂糖为Biowest公司产品。酵母浸出粉、胰蛋白胨为OXIOD公司产品。MilliQ超纯水为实验室自制。DNAmarker为TAKARA公司产品。POWERPacHC高电流电源为BIO-RAD公司产品、GIS凝胶成像仪为上海天能公司产品，DYCP-31DN型电泳槽为北京六一仪器厂产品。1.3菌液培养将含pET-28a和pET-28a-G6PD的大肠杆菌Top10分别划线于含100g/ml卡那霉素的LB平板中，37℃倒置培养15h.挑单菌落各1个，接种至40ml〔装于250ml三角瓶中〕含50g/ml卡那霉素的LB中，于摇床内37℃250r/min培养，用上述不含菌液的LB作为空白对照，用可见分光光度计测定600nm处的菌液的光密度值〔OD600〕，至OD600为1.6,停止培养。1.4取1.4ml菌液抽提质粒利用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。步骤如下：①分别从各瓶汲取菌液1.4ml至1.5ml管心管，室温10000r/min,离心30s,弃上清；②加250l溶液P1,3000r/min涡旋1min;③加250l溶液P2,温和颠倒混匀10次，室温静置4min;④参加350l溶液P3,温和颠倒混匀10次；⑤室温12000r/min离心6min;⑥取750l上清于另一1.5ml离心管，室温14000r/min离心10min;⑦取600l上清于吸附柱中，室温9000r/min离心30s;⑧弃滤液，向吸附柱中加500lWD1,室温10000r/min离心1min;⑨弃滤液，向吸附柱中加500lwashbuff-er,室温10000r/min离心1min;⑩重复⑨一次；瑏瑡弃滤液，将吸附柱置于收集管中，室温13000r/min离心2min;瑏瑢将去盖的吸附柱置于灭菌的1.5ml离心管，做好标记，向吸附柱中参加80l灭菌超纯水，室温静置2min,13000r/min离心1min,收集滤液，冰浴备用。1.5取20.7ml菌液抽提质粒分别从各瓶取菌液0.7ml至1.5ml离心管，平行抽提两份，按1.4①-⑥抽提质粒，将⑥后的两份平行抽提的上清各600l收集于1.5ml离心管，于同一吸附柱内分两次进行⑦，后续步骤与1.4一样。1.6取40.35ml菌液抽提质粒分别从各瓶取菌液0.35ml至1.5ml离心管，平行抽提四份，按1.4中①-⑥抽提质粒，将⑥后的四份平行抽提的上清各600l收集于5ml离心管，于同一吸附柱内分4次进行⑦，后续步骤与1.4一样。1.7质粒的双酶切反响1.4ml,20.7ml,40.35ml菌液抽提的pET-28a经NanoDrop2000测定浓度分别为116,125,130ng/pET-28a-G6PD的浓度分别为120,134,145ng/l.用灭菌超纯水将所有质粒稀释至116ng/l.酶切体系：空质粒〔或重组质粒〕1g,NdeⅠ、XhoⅠ各1l,10FDGreenBuffer2l,加水至20l.混匀，37℃酶切1h.1.8双酶切质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定配制1.2%的琼脂糖凝胶。将2l1kbDNAladdermarker〔与13l1TAE及3l6LoadingBuffer混匀〕、双酶切的pET-28a、双酶切pET-28a-G6PD全量参加上样孔，130V电泳30min.1.9质粒纯度的测定利用NanoDrop2000测定三种策略抽提的质粒pET-28a和pET-28a-G6PD的OD260、OD280值，评估质粒纯度。1.3-1.9的实验进行4次重复〔独立实验〕。2结果2.1双酶切后的质粒电泳图谱按策略1.4,1.5,1.6抽提的质粒酶切后电泳图谱见图1.可知，按1.4策略抽提的质粒pET-28a和pET-28a-G6PD双酶切后均严重弥散，尽管第2泳道中酶切产生的大片段〔略大于5000bp〕、小片段〔介于1000-2000bp〕分别与pET-28a〔5239bp〕、G6PD分子量〔1548bp〕相符，但其相对亮度与理论不符；按1.5策略抽提的pET-28a酶切后在1000bp范围内弥散明显减少，pET-28a-G6PD酶切后的弥散有明显改善，大片段的亮度明显高于小片断；按1.6策略抽提的pET-28a和pET-28a-G6PD酶切后的弥散几乎完全消失，pET-28a-G6PD酶切产生的大、小片段亮度比值接近理论值。2.2质粒纯度测定策略1.4,1.5,1.6抽提的质粒pET-28a和pET-28a-G6PD的4次实验的OD260/OD280平均值分别为1.36和1.45,1.65和1.70,1.75和1.78.可见，菌液越少，质粒的纯度越高，所含蛋白杂质越少。3讨论质粒的双酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理简单，易于把握；但要获得理想的琼脂糖凝胶电泳图片，需要在多个环节上下功夫。导致电泳图片效果不佳的原因很多，有些无法从文献找到答案:，需根据详细情况分析，并用实验检验。酶切后弥散是琼脂糖凝胶电泳常见的实验现象之一，导致弥散的原因有：①质粒DNA中含有DNase,在酶切缓冲液的Mg2+作用下激活，水解质粒[3].②不正确的酶切，如酶用量太多、酶切时间过长、酶切缓冲液错误，导致质粒被切碎。③不合理的电泳缓冲液，如缓冲液陈旧、缓冲液配制错误〔如pH和盐离子浓度错误〕。④琼脂糖凝胶配制错误。本研究所用菌株Top10为endA〔编码非特异性DNA内切酶Ⅰ〕突变型，同时溶解质粒的超纯水均为灭菌后一次使用，可排除DNA酶对质粒的降解。随着优质的限制性内切酶及其通用缓冲液的出现，酶切操作极为简便，不正确酶切发生的概率很小。即用型商品化电泳缓冲液的推出，极大减少了因缓冲液和琼脂糖配制错误所致的弥散。为此，笔者揣测电泳弥散与上述四个原因无关，可能是质粒纯度低所致。固然试剂盒法提取质粒速度快、纯度高[4],但仍有不少细节需要在操作时注意。如讲明书要求取过夜培养的菌液1.5-5ml用于质粒的抽提，华而不实过夜培养是一个模糊时间，8-16h均可以为是过夜培养，不同过夜培养时间导致的菌液浓度相差悬殊。除此之外接种时菌落的生长状态和大小，以及菌株的生长速度均会导致一样培养时间菌液浓度不一。故需要探索菌液用量，调整抽提策略，而不能尽信书.在根据1.4,1.5,1.6的策略抽提时，发现向1.4ml菌液所含菌体中参加溶液P2裂解后，需要在颠倒混匀后静置4min,菌体才变为透明的溶液；用0.7ml或0.35ml菌液抽提质粒时，参加溶液P2颠倒混匀后，立即变为澄清溶液，无需静置，且三种策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取1.4ml菌液抽提质粒，不进行菌液用量的比拟，很容易以为1.4的透明溶液就是澄清溶液，就继续后续的操作步骤。如不测定质粒纯度，贸然进行酶切操作，极易导致酶切鉴定图片质量不佳，甚至导致无法观察到酶切产生的目的条带，严重影响结果的判定。同时，不纯的重组质粒严重影响测序[5].纯度测定表示清楚，等量的菌液分成小份屡次抽提所得到的质粒纯度逐步提高，酶切后电泳弥散现象逐步消失。其原因可能是分次抽提时，菌体充分裂解，蛋白和基因组DNA充分变性，在参加溶液P3后变性的蛋白和基因组DNA沉淀更完全，故蛋白质和基因组DNA污染减少；同时因裂解单位质量的菌体所用的溶液P1〔含有RNA酶〕增加，RNA也去除得更彻底。总之，通过本文的研究，笔者发现采用双酶切联合琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒时，质粒的抽提策略对酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响。用太多的菌液抽提质粒，因裂解不充分，导致菌体蛋白等杂质难以去除，所提质粒纯度低，易导致双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散。以下为参考文献：[1]蒋俊豪，贺修胜。PC