紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法PPT第1页，课件共37页，创作于2023年2月第十章紫外-可见分光光度法第一节概述第二节紫外-可见分光光度法的基本原理

第三节紫外-可见分光光度计

第四节定性和定量分析方法第2页，课件共37页，创作于2023年2月1．电磁辐射与电磁波谱、物质对光的选择性吸收等基础知识。2．紫外-可见分光光度法的基本原理。3．紫外-可见分光光度计的主要部件、仪器类型、测量条件的选择。4．定性和定量分析方法。学习要点第3页，课件共37页，创作于2023年2月知识目标教学目标能力目标1、理解掌握朗伯－比尔定律的意义及应用。2、掌握紫外光谱定量分析的原理和方法。1、学会分光光度计的使用。2、初步学会对物质进行定性、定量分析。第4页，课件共37页，创作于2023年2月第一节光谱分析法概述

一、电磁辐射与电磁波谱

电磁辐射：是一种以电磁波的形式在空间不需任何物质作为传播媒介的高速传播的粒子流。它既具有波动性，又具有粒子性，即波粒二象性。

（一）波动性

光的波动性用波长λ、频率υ或波数σ等主要参数描述。（二）粒子性

第5页，课件共37页，创作于2023年2月二、物质对光的选择性吸收单色光：单一波长的光复合光:由不同波长的光组合而成的光互补色光:

把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合，也可以成为白光。这两种单色光就称为互补色光白光青蓝青绿黄橙红紫蓝第6页，课件共37页，创作于2023年2月

不同物质对各种波长光的吸收程度是不相等的，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。如果物质选择性地吸收了某些波长的光，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定，即物质呈现的颜色是其吸收光颜色的互补色。光的选择性吸收第7页，课件共37页，创作于2023年2月光学分析法非光谱法光谱分析法折射法

旋光法

比浊法

衍射法

发射光谱法散射光谱法吸收光谱法测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法。

γ射线、X荧光、原子发射、原子荧光、分子荧光

瑞利散射和拉曼散射可见、紫外、红外分光光度法

三、光谱分析法的分类第8页，课件共37页，创作于2023年2月紫外-可见分光光度法（UV-Vis)：研究物质在紫外（200-400nm）-可见光（400-760nm）区分子吸收光谱的分析方法。特点：

1.灵敏度高2.精密度和准确度较高3.仪器设备简单4.选择性较好5.应用范围广光谱分析法分类第9页，课件共37页，创作于2023年2月（一）透光率与吸光度

当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被介质吸收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It,反射光的强度为Ir则它们之间的关系为I0＝Ir+Ia+It第二节基本原理一、朗伯-比尔定律第10页，课件共37页，创作于2023年2月在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相同材质的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不变的(一般约为入射光强度的4％)其影响可以互相抵消，于是可以简化为I0＝It+Ia

当入射光的强度I0一定时，如果Ia越大，It就越小，即透过光的强度越小。基本原理第11页，课件共37页，创作于2023年2月

（二）朗伯-比尔定律

1.朗伯定律A=K1L2.比耳定律A=K2c

3.朗伯-比耳定律

A=KcL朗伯-比尔定律：当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的某一含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、强度、溶液温度等条件不变的情况下，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。基本原理第12页，课件共37页，创作于2023年2月（三）吸光系数1.摩尔吸光系数

当溶液浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位为cm时，K称为摩尔吸光系数，用ε表示，单位为L/(mol·cm)2.百分吸光系数

当c的单位为g/100ml，L的单位为cm时,K用表示，称为吸光系数，其单位为单位为ml/(g·cm)。

与ε间的关系：

基本原理第13页，课件共37页，创作于2023年2月二、吸收光谱

紫外-可见吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。在溶液浓度和液层厚度一定时，测定物质在不同波长下的吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标所绘制的曲线，称为吸收光谱曲线，又称吸收光谱、吸收曲线。

1.吸收峰2.吸收谷3.肩峰4.末端吸收第14页，课件共37页，创作于2023年2月三、偏离朗伯-比尔定律的主要因素（一）光学因素

1.非单色光的影响2.非平行入射光、反射、散射

（二）化学因素

1．溶液浓度过高引起的偏离2．介质不均匀引起的偏离3．化学变化所引起的偏离

（三）仪器因素

第15页，课件共37页，创作于2023年2月一、分光光度计的主要部件光源单色器显示样品室检测器第三节紫外-可见分光光度计光源提供可覆盖广泛波长的复合光，复合光经过单色器转变为单色光，当单色光通过吸收池中待测溶液时，一部分光被吸收，一部分光透过溶液照射到检测器上，检测器把接收到的光信号转换成电信号，经信号处理系统后在显示器上显示相应的吸光度或透光率等数值。第16页，课件共37页，创作于2023年2月（一）光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320-2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185-400nm的连续光谱。主要部件第17页，课件共37页，创作于2023年2月远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~400nm400nm

~760nm760nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m光谱区光源第18页，课件共37页，创作于2023年2月（二）单色器

单色器的作用：

将光源发射的复合光变成所需波长的单色光。单色器由狭缝、准直镜及色散元件等组成。来自光源并聚焦于进光狭缝的光，经准直镜变成平行光，投射于色散元件上，色散元件使各种不同波长的平行光有不同的投射方向(或偏转角度)，形成按波长顺序排列的光谱。再经过准直镜将色散后的平行光经聚焦元件聚焦于出光狭缝上。转动色散元件的方位，可使所需波长的光从出光狭缝射出。

主要部件第19页，课件共37页，创作于2023年2月入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400

棱镜的色散作用是由于棱镜材料对不同波长的光具有不同的折射率因此可将复合光中所包含的各个波长从长波到短波依次分散成一个连续光谱。

单色器第20页，课件共37页，创作于2023年2月M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图

光栅是根据光的衍射原理，使光发生色散而产生一系列光谱的色散元件。是一种在高度抛光的玻璃表面上刻有大量等宽、等间距的平行条痕的光学元件。

单色器第21页，课件共37页，创作于2023年2月（三）吸收池

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英和玻璃两种材料。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。主要部件第22页，课件共37页，创作于2023年2月（四）检测器

检测器是一种光电换能器，是将接收到的光信息转变成电信息的部件。常用的有光电管和光电倍增管，近年来使用光多道检测器，具有快速扫描的特点。主要部件光电管光电倍增管第23页，课件共37页，创作于2023年2月信号处理与显示器的作用：将检测器检测到的电信号经过放大以某种方式将测量结果显示出来。显示器常用的有电表指示、数字显示、荧光屏显示、曲线扫描及结果打印等。显示方式主要有透光率与吸光度，有的还能转换成浓度、吸光系数等显示。

（五）信号处理与显示器主要部件第24页，课件共37页，创作于2023年2月二、分光光度计的类型

（一）单光束分光光度计第25页，课件共37页，创作于2023年2月（二）双光束分光光度计第26页，课件共37页，创作于2023年2月（三）双波长分光光度计第27页，课件共37页，创作于2023年2月（四）光多道二极管阵列检测分光光度计1光源2、5消色差聚光镜3光闸4吸收池6入口狭缝7全息光栅8二极管阵列检测器第28页，课件共37页，创作于2023年2月（五）光导纤维探头式分光光度计第29页，课件共37页，创作于2023年2月第四节定性和定量分析方法一、定性分析方法（一）比较吸收光谱的一致性

例如：三种甾体激素盐酸泼尼松、盐酸氢化可的松、盐酸可的松三者有几乎完全相同的λmax（240nm）、（390）、ε（1.57×104）,如图所示中可看出它们的吸收曲线有某些差别，据此可以鉴别。第30页，课件共37页，创作于2023年2月（二）比较吸收光谱特征性常数的一致性例如：丙酸睾丸素和甲基睾丸酮在无水乙醇中的最大吸收波长λmax相同，都是240nm，但在该波长处的不同，前者为460，后者为540，据此可加以区别。

λmax和峰值吸光系数或εmax是最常用于定性鉴别的吸收光谱的特征性常数，若一个化合物有几个吸收峰，并存在谷和肩峰，应该同时作为鉴定依据，从而显示光谱特征的全面性。定性分析方法第31页，课件共37页，创作于2023年2月（三）比较吸光度（或吸光系数）比值的一致性

例如：维生素B12的吸收光谱有三个吸收峰，分别在278nm、361nm、550nm波长处。中国药典（2010版）规定用下列比值进行鉴定：

=1.70～1.88=3.15～3.45若样品吸收峰与标准品相同，吸光度或吸光系数的比值也在上述范围之内，则可认为样品即为维生素B12。定性分析方法第32页，课件共37页，创作于2023年2月二、纯度检查（一）杂质检查

（二）杂质限量检查

肾上腺素中肾上腺酮的检查：

在310nm处，肾上腺酮有吸收峰，而肾上腺素没有吸收。可利用λmax=310nm检测肾上腺酮的混入量。该法是将肾上腺素样品，用0.05mol/LHCl溶液制成每lml含2mg的溶液，在lcm吸收池中，于310nm处测其吸光度A值。规定A值不得超过0.05。

第33页，课件共37页，创作于2023年2月三、定量分析方法（一）吸光系数法例：维生素B12的水溶液在361nm处的为207，现将其盛于2cm的吸收池中，测得溶液的吸光度是0.621，计算溶液的浓度。

第34页，课件共37页，创作于2023年2月（二）标准对照法

标准对照法简称对照法，又称比较法。在测定时，按照各品种项下规定的方法，在相同条件下配制样品溶液和标准品溶液，在规定波长处测其吸光度A样和A标。因为是同种物质，在同一波长下，用同一厚度的吸收池在同一台仪器上进行测量，所以吸光系数相同，即ε样=ε标；液层厚度相同，即L样

=L标。～定量分析方法第35页，课件共37页，创作于2023年2月（三）标准曲线法

标准曲线法又称工作曲线法、校正曲线法，测定时，先取与被测物质含有相同组分的标准品，配制成一系列不同浓度的标准溶液，测定标准系列的吸光度，以浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制A-