第五章灭菌和菌种保藏

第五章灭菌和菌种保藏第1页，课件共29页，创作于2023年2月污染杂菌的危害

1.消耗营养物质。2.分泌抑制发酵生长的有害物质。3.分泌严重改变培养液性质的物质。4.分泌抑制产物生物合成的有毒副作用的物质。5.产生破坏代谢产物的酶类。轻者影响产量，重者导致全军覆没

要认真做好培养基、发酵设备、管道与附件的灭菌、空气除菌、严格控制生产操作第五章灭菌第2页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理灭菌：是指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。工业中常用的灭菌方法：化学物质灭菌、热灭菌（包括干热灭菌和湿热灭菌）、辐射灭菌和过滤介质除菌。第五章灭菌第3页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理一、几种常用灭菌方法的基本原理

(一)化学物质灭菌甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭、氯化汞、表面活性剂等与微生物细胞中某种化学成分反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等。

生产中使用的培养基里含有蛋白质等营养物质亦易于与上述化学物质发生化学反应，同时药物加入培养基之后很难除掉。

所以不能用于培养基的灭菌，只能用于空间、设备、和器械的消毒灭菌。第五章灭菌第4页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理一、几种常用灭菌方法的基本原理(二)辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。紫外线：有效波长2400-3000Å，对微生物有高度致死效应，主要是与菌体核酸的光化学反应而造成菌体死亡。对营养细胞和芽孢均有效。但穿透力低，只适于表面灭菌。第五章灭菌X射线和γ射线:使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，阻碍微生物代谢活动而导致菌体迅速死亡。虽然灭菌效果好，但穿透力强，不安全不经济。第5页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理一、几种常用灭菌方法的基本原理

(三)干热灭菌

指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的过程。一般160℃，1小时。主要用于需要保持干燥的器械、容器的灭菌。第五章灭菌第6页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理一、几种常用灭菌方法的基本原理

(四)湿热灭菌是直接蒸汽灭菌，蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，短时间内杀死微生物。经济快速，被广泛应用与工业生产。第五章灭菌第7页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理二、湿热灭菌的原理

大多数微生物最适温度为25~27℃,维持生命活动的温度为5~50℃，当温度超过最高限温时微生物就会发生死亡。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。微生物的营养体、芽孢和孢子的结构不同，对热的抵抗力也不同。

无芽孢菌在60℃保温10min即可全部被杀死。

芽孢要在100℃下保温10min到几小时才能被杀死。

嗜热细菌在120℃下仍可耐受20~30min。第五章灭菌第8页，课件共29页，创作于2023年2月第一节灭菌的基本原理热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要是温度和加热方式）的致死时间。一般所指的灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。第五章灭菌第9页，课件共29页，创作于2023年2月对数残留定律：微生物在灭菌过程中，是随时间逐渐死亡的，其减少速率(dN/dt)与一瞬间残留的菌数成正比。第五章灭菌第一节灭菌的基本原理实际设计时常用Nt＝0.001即1000批次的灭菌中只有一批失败。相同条件下，不同微生物的K值是不同的，K值越小，热阻越大。第10页，课件共29页，创作于2023年2月一、培养基的灭菌温度选择用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。绝大多数培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都属于一级分解反应。ArrheniusEquation:第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌微生物营养成分反应速度常数增加的倍数第11页，课件共29页，创作于2023年2月一、培养基的灭菌温度选择随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。

Q10：温度升高10℃时的反应速度常数与原温度时的反应速度常数的比值。一般的化学反应Q10为：1.5~2.1杀灭微生物营养体的反应Q10为：5~10杀死芽孢时的反应Q10为：35第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌微生物营养成分

芽孢VB2118℃,15min99.99%10%120℃,1.5min99.99%5%采用高温快速灭菌方法，即可达到杀死培养基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏第12页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法分批灭菌和连续灭菌（一）分批灭菌（实罐灭菌）

是将配置好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。这种方法不需要其他的附属设备，操作简便，是国内外生产中常用的方法。但加热和冷却时间较长，营养成分有一定的损失，罐利用率低，不能采用高温快速灭菌工艺。第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌第13页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法分批灭菌和连续灭菌（一）分批灭菌第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌t1t2t3加热维持冷却如果知道t1和t3，合理设计维持时间t2，也能减少灭菌过程中培养基营养成分的破坏。发酵罐容积越大，加热和冷却的时间越长，这两段时间实际上也有一定的灭菌作用。第14页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法分批灭菌和连续灭菌（一）分批灭菌

1.加热和冷却时间的工艺计算第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌第15页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法分批灭菌和连续灭菌（一）分批灭菌

1.加热和冷却时间的工艺计算第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌第16页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法

Del因素：灭菌程度的对数值，用U表示。（一）分批灭菌

2.维持时间t2的工艺计算第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌Del因素第17页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法（二）连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐的工艺过程。特点：

1.迅速，损失少。

2.发酵罐非生产占用时间少，容积利用率高。

3.自动化，热能利用率合理。

4.不适用于粘度大和固形物含量高的培养基。

5.增加设备、操作环节、染菌机率。第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌第18页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法（二）连续灭菌

1.由热交换器组成的连续灭菌系统第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌新鲜培养基第一个热交换器20~30s,90~120℃第二个热交换器140℃,30~120s第三个热交换器20~30s含淀粉培养基须用酸或酶水解后再用连续灭菌，否则黏度太大，影响灭菌1mm悬浮颗粒须增加1s，1cm须增加100s，所以培养基中颗粒＜2mm发酵罐第19页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法（二）连续灭菌

2.蒸汽直接加热培养基的连续灭菌系统第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌新鲜培养基直接蒸汽加热140℃热交换器回收热能由于冷凝，培养基被稀释，灭菌温度和压力的控制受影响。发酵罐第20页，课件共29页，创作于2023年2月二、培养基的灭菌方法（二）连续灭菌

3.由连消塔、维持罐和冷却器组成的连续灭菌系统第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌第21页，课件共29页，创作于2023年2月第五章灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌三、发酵设备的灭菌第22页，课件共29页，创作于2023年2月一、空气除菌的方法城市上空空气中含有的细菌数为3000-10000个/m2，因此在空气引进发酵罐之前必须进行严格处理，除去其中含有的微生物和其他有害成分。

酵母培养过程中耗氧量大，无菌程度要求不十分严格，可采用高压离心式鼓风机通风即可。

抗生素等多数品种发酵，耗氧量大，无菌程度要求十分严格，所以空气必须先经过严格的无菌处理后才能通入发酵罐内

加热灭菌：可用蒸汽、电能、空气压缩过程中产生的热量进行灭菌。空气压缩对无菌程度要求不高的发酵过程是可行的。

介质过滤除菌：把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。

静电除菌

化学灭菌等第五章灭菌第三节空气除菌第23页，课件共29页，创作于2023年2月一、无菌检查（一）无菌试验

1.肉汤培养法2.斜面培养法3.双碟培养法（二）染菌的判断

1.连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或浑浊。

2.双碟上连续3个时间样品长出杂菌

3.检查样品保留，以备长期监测。一般12小时后。第五章灭菌第四节无菌检查与染菌处理第24页，课件共29页，创作于2023年2月二、染菌的处理（一）污染杂菌的处理

1.种子罐的处理

2.发酵罐的处理

3.染菌后设备的处理（二）污染噬箘体的处理噬菌体污染后发酵液转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留菌丝片段，平皿中出现典型的噬菌斑，营养成分很少消耗，产物合成停止。

处理方法：发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉，严防发酵液任意流失；全部停产，对环境进行全面的清洗和消毒，断绝噬菌体的寄生基础；更换生产菌种，筛选抗噬菌体的菌种，防止重复污染。第五章灭菌第四节无菌检查与染菌处理第25页，课件共29页，创作于2023年2月第六章菌种保藏第26页，课件共29页，创作于2023年2月一、理想的菌种保藏方法应具备的条件1、

经长期保藏后菌种存活健在；2、

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。3、菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。第27页，课件共29页，创作于20