第二章 基因工程的工具酶

第1页，课件共37页，创作于2023年2月第一节限制性核酸内切酶

一.限制性内切酶的发现HamiltonO.Smith1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。1978年获得诺奖。此前（20世纪50年代），研究人员在噬菌体感染大肠杆菌试验中发现了寄主细胞的限制和修饰现象（R/M体系）。第2页，课件共37页，创作于2023年2月二.寄主的限制和修饰现象第3页，课件共37页，创作于2023年2月

限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。第4页，课件共37页，创作于2023年2月修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。第5页，课件共37页，创作于2023年2月1）

菌株中有三个连锁的基因位点：hsdR、hsdM、hsdS。2）

hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。

（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）

hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）

hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。

三.限制和修饰作用的分子机制第6页，课件共37页，创作于2023年2月第7页，课件共37页，创作于2023年2月四.限制性核酸内切酶的概念和命名

概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

命名：1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出了命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类：★用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字母(大写)和种名的前两字母(小写)组成3个字母的略语作为该酶的基本名称。★如果酶是存在于特殊的菌株中，还应在第3个字母后面标注菌株名称的符号株或型(strain)

。★如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示该菌株中发现某种酶的先后次序。第8页，课件共37页，创作于2023年2月Hind

III属名种名

株名

发现顺序Hin

d

III嗜血流感杆菌（Haemophilusinfluenzae

）

d株所发现的第三个限制性内切酶。EcoRⅠ来自于EscherichiacoliRY13的第一个限制酶。举例+读法第9页，课件共37页，创作于2023年2月五.限制性内切酶的种类识别序列切割序列限制酶的作用模型识别序列：是一段特殊的DNA序列，该序列与其对应的限制性内切酶结合，是该酶切割DNA的前提。切割序列：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的DNA序列。第10页，课件共37页，创作于2023年2月Ⅰ型酶:1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。特征：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。

由于切割的随机性，不能得到目的片段。第11页，课件共37页，创作于2023年2月Ⅲ型酶:这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3’端24~26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。

Ⅱ型酶（重点）★1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分离出来的限制酶。★分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在。★特点：（1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。（2）许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。第12页，课件共37页，创作于2023年2月Ⅲ型酶:这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3’端24~26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。

Ⅱ型酶（下节重点）

第13页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征绝大多数II型限制性内切酶都能识别由4-6个核苷酸组成的特定序列。6.1每一种酶都有各自的特异识别序列限制性内切酶是在DNA分子双链的识别序列内切割DNA分子，因此识别序列又称为该限制性内切酶靶序列。

EcoRI:GAATTCBamHI:GGATCCPstI:CTGCAGSmaI:GGGCCC第14页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征限制性内切酶II的识别序列具有双重（180度）旋转的对称结构，也就是说识别序列的核苷酸对是呈回文结构。AGCGCTTCGCGAACNGTTGNCA第15页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征习题：下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列？

A：ATATCGB：CCCGGGC：GATATCD：AGCCGA2个方法：对折or写出互补链第16页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式平末端的DNA片段5`端具有粘性末端的DNA片段3`端具有粘性末端的DNA片段切割位点位于识别序列的对称轴上，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断，不易重新环化。切割位点位于对称轴的两侧，产生突出末端，在适当温度下，产生的末端可以退火互补，重新连接。CCCGGGGGGCCC5’5’CCC

GGGGGG

CCC5’5’SmaI第17页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式第18页，课件共37页，创作于2023年2月识别序列切割位点粘性末端第19页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同。EcoRI酶切产生的5’粘性末端;PstI酶切产生的3’粘性末端；Pvull酶切产生的平头末端；第20页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同第21页，课件共37页，创作于2023年2月第22页，课件共37页，创作于2023年2月第23页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点识别序列不同，产生相同的粘性末端——同尾酶。一些限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称之为同尾酶。由一对同尾酶分别产生出的粘性末端共价结合形成的位点，称之为杂种位点(hybridsite)。实例（百度文库——自学）：1.利用三引物PCR和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组。2.同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用。

第24页，课件共37页，创作于2023年2月杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHⅠ

GGATCC

BclⅠ

TGATCA

CCTAGG

ACTAGT

杂种位点

TGATCC

A

CTAG

GSau3AⅠ第25页，课件共37页，创作于2023年2月第26页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点识别简并序列

简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。例如：GTYRACY=C或TR=G或A

HindⅡ实际上可以识别4个特定序列。

第27页，课件共37页，创作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点

识别序列相同，切割位点不同——同位酶。一些限制性内切酶，具有相同的识别位点，但切割部位不同，这类酶称为同位酶。SmaⅠCCCGGGCCCGGGXmaⅠ双酶切&酶的价格第28页，课件共37页，创作于2023年2月一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这类酶称为同裂酶。如：HpaII/MspI。

CCGGHpaII不能切割MspI能够切割C*CGGC*CGG表示甲基化6.3限制酶的切割特点六.Ⅱ型限制酶的基本特征第29页，课件共37页，创作于2023年2月Ⅱ型限制性内切酶不具甲基化功能。Ⅰ、Ⅲ型限制性内切酶本身具有甲基化酶的功能。Ⅱ型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。6.3限制酶的切割特点GAATTCCTTAAGEcoRⅠ甲基化酶AAEcoRⅠ六.Ⅱ型限制酶的基本特征第30页，课件共37页，创作于2023年2月七.Ⅱ型限制酶的主要用途①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。第31页，课件共37页，创作于2023年2月八.酶切反应的操作◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/L

NaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μL

Temperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。bufferHMKL？？？第32页，课件共37页，创作于2023年2月＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0L（总体积决定）Water16.5L（可变）DNA1.0Lor1.0

g（可变）Enzyme0.5-1.0LVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT八.酶切反应的操作第33页，课件共37页，创作于2023年2月对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。0.1倍体积的5MNaAcpH5.4；2.5倍体积的冰冷乙醇；冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥；九.联合酶解（双酶切）沉淀DNA的方