环境生物技术生物技术在环境工程中的应用

环境生物技术课件生物技术在环境工程中的应用第1页，课件共55页，创作于2023年2月内容提示本章概要介绍酶、微生物制剂、生物表面活性剂、生物絮凝剂和沉淀剂等制备技术在环境工程领域的应用前景；可以提高处理效率，而且符合环保，愈来愈受到关注。利用生物质能的微生物发酵产氢，提供清洁能源很有希望，有应用的可能性和实用性。第2页，课件共55页，创作于2023年2月微生物学新技术

遗传诱变育种基因工程酶工程微生物制剂生物表面活性剂等的技术生物絮凝剂和沉淀剂此处简单介绍适宜在环境工程领域应用的几种。第3页，课件共55页，创作于2023年2月第一节固定化酶和固定化细胞在环境工程中的应用

第二节微生物细胞外多聚物的开发与应用

第三节优势菌种与微生物制剂的开发与应用

第四节微生物能源的开发与应用

第4页，课件共55页，创作于2023年2月第一节固定化酶和固定化细胞

在环境工程中的应用

酶在微生物体内的一切生物化学反应中起着极其重要的催化作用，将它提取出在体外也能发挥其作用。故能将酶制成酶制剂，在食品加工、印染中棉布退浆、生丝脱胶，制革、制茶、化妆品、发酵工业、医疗、洗涤剂、污（废）水生物处理、废气生物净化等均可应用。根据各行业的需要可使用不同剂型的酶制剂。

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一、酶制剂剂型

（一）干燥粗酶制剂将用麸曲或深层发酵的培养液除菌（或不除菌）后，与淀粉等惰性填料混合、干燥制成粗酶。

（二）稀液体酶制剂将培养液过滤除去菌体等杂质后，直接加稳定剂(甘油、乙醇、氯化钠等的复合物)和防腐剂作为商品出售。国内许多白酒厂用此种液态糖化酶制剂糖化淀粉。第6页，课件共55页，创作于2023年2月

（三）浓液体酶制剂

将培养液过滤除去菌体等杂质、浓缩后再加稳定剂和防腐剂成商品。

（四）干燥粉状酶制剂

我国多数生产此种酶制剂。其制备工艺为：

（五）结晶酶结晶酶是经过高度纯化而结晶的固体酶制剂。在酶溶液中缓慢加入硫酸铵或氯化钠而使溶液接近过饱和状态时，静置于低温（0～4℃）下就可析出结晶酶。酶结晶的条件：酶蛋白浓度在3～50mg/mL,酶的纯度大于50％。不同的酶的pH稳定范围不同。（六）固定化酶

将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可较长时间使用。第7页，课件共55页，创作于2023年2月

二、酶的提取

（一）预处理

在提取酶之前要作预处理。不同的酶有不同的预处理方法。

1.

胞外酶的预处理和制备

存在培养液中，只需将菌体过滤或离心去除，所得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲，用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去菌体及杂物后所得清液即粗酶液。粗酶液再经提纯即酶精制品。

2.

胞内酶的预处理

胞内酶需要破碎细胞壁和质膜，然后制成无细胞提取液，再提纯。

破碎细胞的方法有：干燥法(空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥)、机械法(研磨法、机械捣碎)、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。

第8页，课件共55页，创作于2023年2月(二)酶的提取

酶是比较脆弱的物质，处理不当容易变性，提取前要对目的酶的等电点、pH、温度的稳定性、氧化还原剂对酶的影响有所了解。

1.水溶液提取法

用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。稀盐、缓冲溶液和水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取酶常用的溶剂，提取液的用量是培养液体积的1～5倍。在提取时要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。同时根据不同酶的性质控制好提取温度。多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，适当提高温度，但时间不宜过长，需缩短提取时间。避免温度过高导致酶蛋白质变性失活，一般在5℃以下操作。为了避免提取过程中酶被蛋白水解酶降解，可加入二异丙基氟磷酸和碘乙酸抑制蛋白水解酶活性。特别注意提取液的pH和盐的浓度。

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（1）pH：酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，防止过酸或过碱而引起酶蛋白可解离基团变化，而导致酶蛋白构象的不可逆变化。碱性酶用偏酸性的提取液提取，而酸性酶用偏碱性的提取液提取。

（2）盐浓度：稀浓度盐溶液可促进酶蛋白的溶解度，同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护酶蛋白不易变性的优点，在提取液中加入少量NaCl（0.15mol/L）或其他中性盐。缓冲液常采用0.02～0.05mol/L磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。第10页，课件共55页，创作于2023年2月2.表面活性剂提取法

表面活性剂有天然的胆酸盐、磷脂，合成的有十二烷基硫(磺)酸钠(SDS、阴离子型)、二乙氨基十六烷基溴(阳离子型)、非离子型的有吐温(Tween)及三通－X(Triton－X)。

3.有机溶剂（丁醇）提取法

对不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中的，和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶，可用乙醇、丙酮和丁醇提取，以丁醇最佳。丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；丁醇兼具亲水性；pH及温度选择范围较广，在溶解度范围内（注：0℃时其溶解度为10%，40℃时其溶解度为6.6%）不会引起酶变性失活。故需在低温下操作。

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工业化生产蛋白酶（胞外酶）的提取操作步骤如图12-1。200m3酶活力为200u/mL的发酵原液,经过一系列提取步骤后制成了200kg酶活力为165000u/mL的成品固体酶，或制成1m3酶活力为330000

u/mL的成品酶液，其总收率为82%。

图12-1蛋白酶（胞外酶）工业提取流程图第12页，课件共55页，创作于2023年2月

三、酶的纯化步骤

提取的酶要先浓缩、去杂质再纯化。

（一）浓缩

浓缩的方法有葡聚糖凝胶-分子筛浓缩法、聚乙二醇(PEG)浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离。

（二）去杂质去杂质的方法有：pH沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异、蛋白沉淀剂法。

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（三）纯化

1.

盐析法

盐析法是用中性的硫酸铵(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl、Na2HPO4纯化酶。绝大多数用(NH4)2SO4。

2.有机溶剂沉淀法在酶溶液中缓慢加入相当于酶溶液浓度的两倍的有机溶剂（乙醇或丙酮），以降低酶溶液的电解常数，以增加酶蛋白分子电荷间的引力，导致酶蛋白的电解度下降而沉淀。

3.层析法

层析法有吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析(凝胶过滤层析)法及等电点沉淀法。

（四）结晶当酶达到一定的纯度后，在适当的温度、pH条件下，逐渐加入(NH4)2SO4溶液中，酶可慢慢析出结晶，也可加入某些有机溶剂析出结晶。第14页，课件共55页，创作于2023年2月

二、固定化酶和固定化微生物的固定化方法

(一)固定化酶和固定化微生物

1.固定化酶

从筛选、培育获得的优良菌种体中提取活性极高的酶，再用包埋法(或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统)等方法将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即固定化酶。

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固定化酶的研究始于1910年，正式研究于20世纪60年代，70年代全世界普遍开展。至目前取得很多成果，但多限于简单的胞外酶‒水解酶类、少数胞内酶。固定化水解酶类对大分子降解能力强，对小分子无分解能力。胞内的氧化还原酶类利用很少，发现2100种酶中，有1/5的脱氢酶需要NAD+和NADP+辅酶同时存在才能充分发挥酶的作用。而酰胺类(NAD+和NADP+)辅酶的再生和固定化方法尚未解决。所以,多酶体系的固定化尚有待于研究开发。

第16页，课件共55页，创作于2023年2月2.固定化微生物

将酶活力强的微生物体固定在载体上，即成固定化微生物。

微生物体本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。有死细胞固定化和生长细胞固定化两种。

3.固定化酶和固定化微生物的特性固定化酶和固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降解有机物性能强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷等优点。制成酶布和酶柱后用于连续流运行，酶不会流失。

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（二）固定化酶和固定化微生物的固定方法

1.载体结合法

以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。

2.交联法

酶与两个和两个以上官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。

3.包埋法

将酶包埋在凝胶微小格子(格子型)中，或将酶包裹在半透性的聚合物膜内(微胶囊型)的固定方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺(PAM)凝胶、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、硅胶、角叉菜胶(红藻提取物－凝胶)等。微胶囊型的包埋材料有尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。

第18页，课件共55页，创作于2023年2月4.逆胶束酶反应系统

表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。

以上四种固定化方法见图12-2。除上述四种单独的固定化方法外，还可将两种方法结合使用，能防止酶泄漏。

图12-2酶固定化的模式图A.载体结合法B.交联法C1.包埋法(格子型)C2.包埋法(微胶囊型)D.逆胶束酶反应系统第19页，课件共55页，创作于2023年2月

对微生物细胞的固定化最适合用凝胶包埋法。

固定化酶的酶型：颗粒状的固定化微生物细胞，在连续流工艺中容易会流失。制成酶布和酶柱，解决了酶流失问题。

酶和微生物的载体:

多糖、纤维蛋白、水凝胶、空心纤维、多孔酚醛树脂。无机载体有多孔玻璃、氧化铝、羟基磷灰石、硅氧化铝、多孔陶瓷、不锈钢和砂等。

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五、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用及前景

（一）固定化酶和固定化微生物在废水生物处理中的研究现状

鉴于固定化酶技术只限于水解酶类和少数胞内酶研制成功和应用，多酶体系的固定化技术尚未解决；又由于废水的组分很复杂，而且经常变化。因此，要用多种单一的固定化酶，包括胞外酶和胞内酶组合处理，才能完成某一物质的多步骤反应，才能使有机物完全无机化和稳定化。固定化酶可以制成酶膜、酶布、酶管（柱）、酶粒、酶片。处理动态废水用酶管为好。废水中若含有多种毒物，可按分解毒物成分的次序，沿着废水流动方向，依次按顺序将与各种毒物相对应的酶固定在塑料管内壁不同位置上，制成塑料酶管。见图12-3中所示。

第21页，课件共55页，创作于2023年2月

废水中的氰化物被氰水解酶、甲酰胺酶、甲酸脱氢酶催化作用下，分解为CO2、H2和NH3。其中的酚被酚氧化酶催化氧化为CO2和H2O，结果氰和酚两种毒物能被同时清除，废水得到净化。德国将9种降解对硫磷农药的酶共价结合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水，获得95%以上的去除效果。连续工作70d，酶的活性没有变化。说明多种酶的作用大于单一种酶的作用。

图12-3四种固定化酶在酶管中排列顺序示意图1.氰水解酶2.甲酰胺酶3.甲酸脱氢酶4.酚氧化酶第22页，课件共55页，创作于2023年2月

日本用固定化-淀粉酶处理淀粉废水和造纸白水。美国将固定化酚氧化酶处理含酚废水，固定化酶活性只达到游离细胞的90％。从这个意义讲，用游离细胞处理废水的效果比用单一固定化酶的好。一个微生物体本身就是多酶体系的载体。在废水生物处理中已知：单一种微生物并不能将某一种废水净化彻底。需要多种微生物混合生长组成微生态系，依靠食物链净化废水。同理，制备多种混生的固定化微生物对提高处理效果无疑是有益的。

第23页，课件共55页，创作于2023年2月

(二)固定化酶和固定化微生物在废水生物处理中应用的可能性

城市生活污水和工业废水的水量大，用固定化酶或固定化微生物处理有难度，但应用于小水量的特种工业废水处理有可能实现。

废水处理中的生物膜实质是在各种材质的填料上被固定化了的混生微生物群体。这种固定化不是被包埋在载体内部，而是固定在载体的表面，类似于图12-1，A所示的载体结合法。因固定在载体表面，直接与废水接触，相对上述的固定化酶和固定化微生物，在耐毒和耐冲击负荷方面可能要差些。但相对于活性污泥其抗性则要强许多。第24页，课件共55页，创作于2023年2月(三)固定化微生物在废气生物处理中的应用前景

废气的组分没有废水的复杂，而且将废气由气相转化为液相所产生的废水量不大，其处理难度相对较小。恶臭含硫污染物和挥发性有机污染物均有固定化酶和固定化微生物处理的可行性试验，可望在生产中应用。

第25页，课件共55页，创作于2023年2月

可选用的生物膜载体有：

生物膜载体有鹅卵石、煤渣、陶粒、活性炭(颗粒状、粉状、碳纤维)、纸质蜂窝、塑料波纹板、塑料空心球、软性的和各种构型的半软性塑料填料。

固定化（挂膜）方法有：自然挂膜、优势菌种挂膜和生物工程菌和遗传工程菌挂膜。在大量生产中，目前仍然是自然挂膜和优势菌种挂膜。

生物膜法是废水生物处理和废气生物处理的重要方法之一。与活性污泥法比，在耐毒和耐冲击负荷方面优于活性污泥法，没有活性污泥丝状膨胀问题。与经纯化而制成的固定化酶和固定化微生物比，其培养、固定化(挂膜)的方法简单，成本低，实用性强。

第26页，课件共55页，创作于2023年2月第二节微生物细胞外多聚物的开发与应用

微生物的胞外多聚物(extracellularpolymers,缩写ECP)是微生物在一定的环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的多聚化合物。包括荚膜、黏液层及其他表面物质。这些多聚物经分析得知其成分为脂、脂肽、多糖脂、中性类脂衍生物等。

微生物细胞外多聚物可应用于石油开采工业、农业、环境保护和环境工程等方面，主要用作表面活性剂、絮凝剂或助凝剂和沉淀剂。微生物细胞外多聚物在废水生物处理方面的应用已有报道。在石油炼厂废水和油脂废水的生物处理可考虑应用。微生物的胞外多聚物还可应用于破乳、润湿、发炮和抗静电。第27页，课件共55页，创作于2023年2月

一、生物表面活性剂和生物乳化剂的

开发与应用

生物表面活性剂(biosurfactant)和生物乳化剂（bioemulsifier）是20世纪70年代后期发展起来的，它们是具有亲水基和疏水基结构于一体的两亲化合物，但两者有区别。

生物表面活性剂具有表面活性，它的相对分子质量小，分子中具有脂肪烃链构成的非极性疏水基和有极性的亲水基，如磷酸根或多羟基基团。它可改变两相界面的物理性质，如降低空气-水、油-水或固体-水的表(界)面张力，故称为生物表面活性剂。研究和应用较多的是石油开采工业，因为生物表面活性剂有益于改善稠油油品，使之易于开采。

第28页，课件共55页，创作于2023年2月

生物乳化剂不能显著降低两相表(界)面张力，但对油-水界面有很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，从而使乳状液得以稳定。生物表面活性剂和生物乳化剂一般都能生物降解。可将其分为六类，见表12-1。第29页，课件共55页，创作于2023年2月分类产物类型生产菌1.糖脂

海藻糖脂

鼠李糖槐糖脂节杆菌属（Arthrobacter）、分枝菌属（Mycobacteria）、诺卡氏菌属（Nocardia）、棒杆菌属（Corynebacteria）、红球菌属（Rhodococcus）假单胞菌属（Pseudomonas）2.中性脂/脂肪酸

甘油酸，脂肪酸，脂肪醇，蜡脂蛋白、脂肽、Torulopsis不动杆菌属（Acinetpbacter）、梭菌属（Clostridium）3.含氨基酸类脂

脂氨基酸（Surfactin,PolymixinB）

芽孢杆菌属（Bacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、棒杆菌属（Corynebacterium）、链霉菌属（Streptomyces）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、(Agrobacteria)、葡糖杆菌属（Gluconobacter）4.磷脂

磷脂酰乙醇胺红球菌属（Rodococccus）、硫杆菌属（Thiobacillus）不动杆菌属（Acinetobacter）、地霉属（Candida）5.聚合物

脂杂多糖（Emusan）脂多糖复合物,

蛋白质－多糖复合物红球菌属（Rodococccus）、硫杆菌属（Thiobacillus）不动杆菌属（Acinetobacter）、地霉属（Candida）6.细胞表面本身

生物破乳剂脂肽诺卡氏菌属（Nocardia）、红球菌属（Rodococcus）不动杆菌属（Acinetobacter）表12-1生物表面活性剂和生物乳化剂的分类第30页，课件共55页，创作于2023年2月

二、微生物自身絮凝和沉淀作用

根据单一菌种微生物（纯种）细胞表面的解离层（胞外多聚物）性质不同而划分两种类型，即疏水性的R型（菌落为粗糙型）和亲水性的S型（菌落为光滑型）。凡具有R型解离层的微生物表现疏水性而自身发生絮凝、聚集而沉降，R型细菌适合应用于废水处理。

R.kurane等人从沉降性能良好的活性污泥中筛选出红平红球菌（Rodococcuserythropols），将它用于处理酞酸酯废水，处理效率高，沉淀性能良好，处理水透明。用于糖蜜废水、纸浆黑夜、颜料等废水悬浮液的絮凝、沉淀与脱色，效果也好。还可用于改善膨胀污泥的沉淀效果。具有S型解离层的微生物表现亲水性，均匀分散于水中，不易絮凝，不易沉降。

第31页，课件共55页，创作于2023年2月

活性污泥中的微生物是混合菌种，活性污泥可能全由R型细菌组成，也可能由R型细菌和S型细菌共同组成，这种活性污泥是亲水性还是疏水性，取决于两者的比例及它们的表面电荷。由此也使活性污泥的吸附能力，活性污泥与水之间的表（界）面张力各异，加上活性污泥表面吸附各种废水成分后所表现出来的总体带电性不同，通常为-10～-20mV，会引起活性污泥与水之间的表面张力及它们的表面电荷改变，影响它们对废水中成分的吸附力。因此，其沉淀性能有良好和不好的结果。另外，还可能全由S型细菌组成。它们的比例及它们的表面电荷，与废水成分的关系都有密切关系。若要搞清它们之间的关系，需要用化学测定，但很不容易。

第32页，课件共55页，创作于2023年2月

三、微生物絮凝剂和沉淀剂的开发与应用

在废水生物处理中，二沉池的泥水分离好与坏，取决于活性污泥的絮凝性能和沉降性能。有些活性污泥尽管去除有机物能力强，但它本身的絮凝性能差，需要投加絮凝剂，强化絮凝效果，改善出水水质。

絮凝剂有三类:

第1类为有机高分子絮凝剂或是助凝剂，如聚丙烯酰胺，其投加用量为400mg/L，还有甲壳素。

第2类为无机絮凝剂如硫酸铝、硫酸亚铁、三氯化铁，碱式氯化铝等。投加三氯化铁效果不错，但用量大，达3000mg/L。

第3类为微生物絮凝剂。第33页，课件共55页，创作于2023年2月

微生物絮凝剂是从微生物体提取的的细胞分泌物，它是具有良好的絮凝作用和沉淀效果的水处理絮凝剂。它的成分是糖蛋白、多糖、纤维素、蛋白质等。它易被生物降解，不会引起二次污染，使用安全，其用量较少，只需200mg/L。但目前生产成本较高，随着生物技术的发展，可望降低成本，利于在生产中推广使用。第34页，课件共55页，创作于2023年2月

具有絮凝作用的微生物

将有絮凝作用的微生物经扩大培养而制成的微生物细胞制剂直接用作絮凝剂。或从具有絮凝作用的菌株提取其表面的有效絮凝成分做成制剂用作絮凝剂。

1976年Nakamura等人从214株菌中筛选出19种具有絮凝作用的微生物，其中的酱油曲霉（Aspergillussojae）的A.J7002菌株生产的絮凝剂效果很好。1985年H.Takagi等人培养拟青霉属（Paecilomycessp.1-1），用乙醇沉淀和凝胶色谱法精制成PF101絮凝剂，它的相对分子质量为3×105。其主要成分为半乳糖胺。PF101对枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、活性污泥、纤维素粉、羧甲基纤维素、活性炭、硅藻土及氧化铝均有良好的絮凝作用。

具有絮凝作用的微生物细菌放线菌霉菌原生动物第35页，课件共55页，创作于2023年2月物理方法：高速离心、超声波和均化处理。化学方法：酸水解、热碱法和有机溶剂析出。提取分五个步骤：

提取步骤提取微生物胞外多聚物的方法

①微生物(活性污泥)的浓缩和洗涤②剥取ECP③用有机溶剂析出④富集⑤纯化第36页，课件共55页，创作于2023年2月

四、微生物絮凝剂和沉淀剂的作用原理ECP（胞外多聚物）和活性污泥絮凝的机制尚没定论，一般认为：ECP的酸性多糖通过离子键与活性污泥发生絮凝，ECP的中性多糖通过氢键和活性污泥发生絮凝，ECP起了桥梁作用。ECP具有阴离子基团，可和二价阳离子结合构成三维空间结构，维持絮体完整性。

ECP是生物表面活性剂，可以降低活性污泥和水之间的表面张力，降低两者的亲和性，增加微生物之间及微生物絮团之间的亲和性。增加微生物絮团和活性污泥的疏水性，再加上微生物絮凝剂自身絮凝成大颗粒就变得更易沉淀，达到泥水分离的目的。从这意义讲ECP又成了沉淀剂。第37页，课件共55页，创作于2023年2月第三节优势菌种与微生物制剂的开发与应用

在污（废）水、有机固体废弃物和废气等的生物处理过程中，在自然界的江、河、湖、海及土壤中，存在许多降解天然物质和有机污染物性能良好的菌种。微生物工作者为了开发微生物资源，从各种运行性能良好的活性污泥、生物膜、堆肥及废气处理装置中及自然界中筛选出优良微生物菌种，制成微生物制剂，备各种用途使用。

第38页，课件共55页，创作于2023年2月

一、优势菌种

目前已筛选的菌种有：①降解有毒、有害有机污染物的微生物，如食酚菌、分解氰化物、苯系化合物、萘、菲、蒽、沥青等的微生物。②适应极端环境的微生物，如嗜热菌、嗜冷菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌、耐压菌。③降解农药：如2,4-D、对硫磷、乐果等的微生物。④分解难降解污染物(如废塑料、尼龙)的微生物。⑤降解染料的脱色菌。⑥除臭菌。第39页，课件共55页，创作于2023年2月

二、优势菌种的筛选步骤与菌剂制备

（一）采集样品

从土壤、水体或污水、堆肥取样，在实验室用目的污水曝气驯化培养微生物。

（二）分离培养

从驯化培养物中取少量培养物，用稀释平板分离法分离出单个菌落，将长在平板上的单个不同菌落分别挑取接种在斜面保存。

（三）纯化

将培养出的各种微生物进行多次平板划线分离、纯化，再将纯化的各菌种接入斜面保存。

第40页，课件共55页，创作于2023年2月

（四）进行菌种性能测定

用各种目的污（废）水对各种微生物进行性能测定。

（五）保存菌种

取性能良好的菌种接斜面，于4℃冰箱保存；或真空冷冻干燥保存。

（六）制成成品制剂

最后按废水、废物和废气的化学组分与需要量，将多种菌种合理搭配。经扩大培养后用板框压滤或离心、干燥，制成干活菌制剂。或浆状活菌制剂或液体活菌制剂。

第41页，课件共55页，创作于2023年2月

三、微生物制剂的应用

微生物制剂可应用于：

①生物膜挂膜。

②污（废）水活性污泥法处理过程的添加剂，初沉池、曝气池均可投加，可提高废水处理效率。

③有机固体废弃物堆肥的菌种和添加剂，可加速堆肥腐熟。

④家庭便池、公厕的除臭剂。

⑤禽畜粪便处理的菌种。

⑥污染严重的河道进行生物修复，疏浚河道底泥。⑦降解和清除海面浮油和炼油厂的废弃物。

⑧土地生物修复和河床底泥的生物修复。

第42页，课件共55页，创作于2023年2月

四、微生物制剂的用法

（一）

液体活菌制剂直接使用。

（二）

浆状菌剂稀释成一定浓度（107～1010个/mL）的菌液后使用。

（三）干的活菌制剂

需用30℃左右的温水浸泡若干小时使软化成浆状，加水调成含菌量为107～1010个/mL的菌液再投加。

第43页，课件共55页，创作于2023年2月第四节微生物能源的开发与应用

自然界中存在许多生物能源物质，如水稻、小麦等农作物的秸秆、果实，以及由它衍生出的工业产品：纤维素、半纤维素、淀粉、葡萄糖等。以上这些均是生物能源的原料。而在生产上述产品所产生的工业废水中还残留着许多生物能源物质。如酒精废水、味精废水、淀粉废水中残留的葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉。废水处理中利用微生物进行生物能源的开发，在能源危机的今天，利用废物生产能源是相当有意义的。

第44页，课件共55页，创作于2023年2月

一、微生物能源的种类

微生物能源的种类有甲烷能源、乙醇能源和H2能源。前两种能源研究历史较久。H2能源是新型能源，因它燃烧后变成CO2

和H2O，没有污染，是最清洁、最环保的能源，倍受人们的重视和青睐。

（一）甲烷能源

利用产酸菌和产甲烷菌的协同作用将高浓度有机废水发酵，产生CH4气体作能源。详见第二篇第九章第三节。

（二）乙醇能源

利用酵母菌对葡萄糖发酵产生乙醇。详见第一篇第四章第三节。

（三）H2能源

产生H2能源的方法有多种，利用微生物产生H2是重要方法之一。即利用微生物的脱氢酶和氢化酶将糖类脱氢产生H2的能源。

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二、产H2微生物

（一）不产氧光合细菌

不产氧光合细菌在光照条件下，利用低分子有机物作供氢体，还原CO2构成自身细胞，产生分子更小的有机物和H2O。然而，有的光合细菌（即紫色非硫细菌）却能放出H2

，例如，具有固氮作用的荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonascapsulatus）能持续产氢10d以上。它产氢率45ml/（L·h）。深红红螺菌（Rhodospirillumrubrum）的一种突变株在NH3存在条件下固N2产H2。

产生H2的微生物不产氧光合细菌蓝细菌和绿藻专性厌氧细菌兼性厌氧细菌古菌

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1.不产氧光合细菌产氢的机制

不产氧光合细菌利用有机废水生产H2，是不产氧光合细菌与水解产酸菌混合生长，依靠水解产酸菌对大分子的有机物水解作用，并降解为小分子的有机酸后，再由光合细菌对有机酸的光解作用而产生H2的。如果是工业化生产，可直接用有机酸作基质，不产氧光合细菌就可以直接光解有机酸产氢，不需要与其他细菌混生。

2.不产氧光合细菌产氢的条件需要低分子有机碳化合物，如三羧酸循环的中间代谢产物和甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸、己酸、辛酸等。需要一定光照强度、温度30℃左右、

pH=5.5～7、严格厌氧。第47页，课件共55页，创作于2023年2月

3.利用不产氧光合细菌产氢的优点

不产氧光合细菌的产氢速率高于其他类型的微生物，每克菌体每小时可获得最大产氢量为51mL/（gh）。有的不产氧光合细菌的产氢率甚至高达260mL/（g·h）。由于不产氧光合细菌的光合作用不放O2

，故气体中H2的纯度高。在我国，已有实例利用豆腐制品废水为原料，通过不产氧光合细菌的固定化细胞产氢，在运行93h时，平均产气率为120.7～140mL/（L·d），气体中含氢量在75%以上。在连续运行260h，平均产气率146.8～351.4mL/（L·d），气体中氢的含量在60%以上。目前利用有机废水产氢的产量不够高，有待进一步研究，提高其产氢率和产量。

目前已有国家建立“光合细菌工厂”，每天可生产10t液态氢，作为飞机燃料，试飞取得成功。

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（二）蓝细菌和绿藻

在通常情况下，蓝细菌和绿藻在光照条件下，利用H2O作供氢体，光解H2O为2H+和O2

。H+

将CO2还原为有机物构成自身细胞，放出O2

。1974年，Benemann观察到柱孢鱼腥蓝细菌（Anabaenacylindrica）在光解H2O产生O2的同时，还能固N2放H2。Gaffron也报道了珊藻（Scenedesmus）光解H2O产H2。此外，聚球蓝细菌（Synechococcus）、颤蓝细菌（Oscillatoria）、莱因哈德衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）等均具有产氢能力，其产氢量可达到理论值的15%，它们均可实行大规模生产获得氢能。在德国和美国建立了“藻类农场”、“藻类工厂”，为未来开发无污染的洁净氢能源开辟一条重要途径。

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（三）其他产氢细菌

兼性厌氧菌大肠杆菌（Escherichiacoli）产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）中间柠檬酸杆菌（Citrobacter

intermedius

）严格厌氧菌丁酸梭菌（Clostridiumbutylicum）巴氏梭菌（Clostridiumpasteurianum）克氏梭菌（Clostridiumkluyveri）拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）丙