湿热灭菌工艺的微生物学验证

湿热灭菌工艺的微生物学验证第1页，课件共82页，创作于2023年2月药害事件与GMP的发展cGMP的诞生与发展药害事件中的产品特点成分复杂对质量要求高劣质产品具有致命性患者在使用前无法确定药品的质量2第2页，课件共82页，创作于2023年2月案例分析（续）1972年，英国，德旺波特事故英国德旺波特医院输液灭菌过程不力而导致污染，造成至少5例败血症患者死亡的事故。消毒柜的排气阀已被碎玻璃和纸团堵塞，导致在灭菌时，消毒柜内的空气无法顺利排出，局部空间达不到预定灭菌温度温度记录仪损坏在取样和检测方法上存在失误未按照书面规程操作灭菌釜设备维修保养存在缺陷3第3页，课件共82页，创作于2023年2月其它案例1907鼠疫疫苗破伤风梭菌1943荧光素滴眼液铜绿假单胞菌1946免疫血清疫苗金色葡萄球菌1948滑石粉破伤风梭菌1966抗生素眼药膏铜绿假单胞菌1970洗必泰消毒剂洋葱假单胞菌1972静脉注射剂假单细菌、欧文菌、肠杆菌属亚种1977隐形眼镜护理水黏质沙雷菌、肠道细菌属亚种1981外科敷药梭菌属亚种4第4页，课件共82页，创作于2023年2月注射剂的特点药效迅速，作用可靠可用于不宜口服给药的患者，发挥局部定位作用注射给药不方便，注射时有疼痛制造过程复杂，生产成本高直接入血制剂，质量要求比其它剂型更严格，使用不当更易发生危险5第5页，课件共82页，创作于2023年2月注射剂的质量要求无菌，成品中不得含有活的微生物无热原澄明度，不得有肉眼可见的浑浊或异物安全性，不得引起对组织的刺激性或发生毒性反应渗透压、pH、必要的物理和化学稳定性6第6页，课件共82页，创作于2023年2月无菌药品生产管理要点防止微生物污染防止热原或细菌内毒素的污染防止产品中有异物装量准确7第7页，课件共82页，创作于2023年2月8无菌药品的两种生产方式最终灭菌工艺在高洁净环境下进行灌装和密封通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌封在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险第8页，课件共82页，创作于2023年2月9两种生产方式的比较无菌生产工艺的局限通常的无菌保证水平(10-3至10-6)影响因素多最终灭菌工艺的优点赋予产品更高的无菌保证水平生产中可变因素少，出现偏差的概率低几乎能杀灭产品中的所有微生物第9页，课件共82页，创作于2023年2月10欧盟要求(CPMP/QWP/054/9800)包材热稳定差不得成为采用无菌工艺的唯一理由。企业应当将选择适用于某个处方的最佳灭菌方法放在首位，然后再考虑相应的包装材料。产品包材的选择可能必须考虑许多其它因素…。此情况下，应…在注册申请资料中作出科学合理的解释。…，如容器类型、给药途径…（如某些眼科用药），而该容器无法经受最终热力灭菌，…一般是可以接受的。…此条件下，企业有责任继续寻找可接受的替代容器，以便尽早采用首选的最终灭菌法。由于最终灭菌具有最高的无菌保证水平，因此，不得因商业原因取消最终灭菌法。第10页，课件共82页，创作于2023年2月最终灭菌产品无菌保证的主要环节产品的无菌保证灭菌前微生物污染包装密封性灭菌工艺灭菌设备灭菌工艺验证二次污染原料设备和生产过程生产环境生产时限11第11页，课件共82页，创作于2023年2月无菌工艺产品无菌保证的主要环节产品的无菌保证非无菌生产过程（控制微生物污染）包装密封性设备材料药液的灭菌原料设备和生产过程生产环境生产时限工艺设计＋人员防护操作模式环境监测与评价无菌生产工艺验证质量标准、微生物学检验方法及验证、设备与工艺验证、环境监测、工艺与过程控制、更衣、人员培训无菌生产过程(防止微生物污染)12第12页，课件共82页，创作于2023年2月灭菌工艺在无菌药品生产中的应用最终灭菌产品

灌装在容器中的药品必要时，产品溶液或粉末、内包装材料、设备、管路必要时，用具、人员防护装备等无菌工艺产品

产品的组分、内包装材料和直接接触设备

A级（或ISO5级）内，任何接近产品的材料、人员防护装备、用具等13第13页，课件共82页，创作于2023年2月灭菌的主要目的

杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽胞最大限度地提高药物制剂的安全性保护制剂的稳定性保证制剂的临床疗效研究、选择有效的灭菌方法，对保证产品质量具有重要意义14第14页，课件共82页，创作于2023年2月经典灭菌方法在制药业中的应用最终灭菌药品湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法无菌工艺药品除菌过滤法（如产品、工艺气体等）湿热灭菌法、干热灭菌法辐照灭菌法（如防护装备、滤器、一次性用具等）液体灭菌法（如某些生物制品、器械）气体灭菌法（如防护装备、滤器等）低温蒸汽灭菌法（进入隔离器的包装材料等）15第15页，课件共82页，创作于2023年2月灭菌工艺的设计原则产品特定性灭菌工艺过度杀灭法灭菌工艺验证时和日常灭菌前微生物监控所需要的信息量预计效期供热量上升上升下降16第16页，课件共82页，创作于2023年2月灭菌工艺的设计原则Bioburden-basedprocess含菌量控制工艺StabilityStabilityStabilitySterilitySterilitySterilityOverkillprocess过度杀灭工艺相同温度下时间递增灭菌前含菌量和耐热性监控信息需求递增（USP）Biologicalindicator/bioburdencombinedprocess生物指示剂/含菌量联合控制工艺17第17页，课件共82页，创作于2023年2月18湿热灭菌又称为Moistheatsterilizationunderpressure细胞内起关键作用的蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用。只要可能，通常取121℃（2个大气压）优点：无残留，不污染环境，不破坏产品表面，容易控制和重现性好包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器、过热水灭菌器等第18页，课件共82页，创作于2023年2月湿热灭菌国外法规和指南USPISO17665ISO11138-BI,ISO11140-CIHTM2010EN554,285PDATechnicalReportNo.1脉动真空灭菌器示意图19第19页，课件共82页，创作于2023年2月干热灭菌原理：使微生物氧化而不是蛋白质变性，因此温度要高得多，时间也相应延长利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的特点，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热灭菌适用于耐高温但不适于湿热或可被湿热破坏的物品，如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类，耐高温的粉末化学药品等干热灭菌不适用于橡胶、塑料及大部分药品。20第20页，课件共82页，创作于2023年2月干热灭菌国外法规和指南USPISO11138-BI,ISO11140-CIISO20857PDATechnicalReportNo.3PDATechnicalReportNo.721第21页，课件共82页，创作于2023年2月气体灭菌灭菌剂的种类环氧乙烷（ETO，C2H4O）臭氧（Ozone，O3）二氧化氯（ChlorineDioxide-ClO2）气体灭菌不同于低温蒸汽灭菌22第22页，课件共82页，创作于2023年2月辐射灭菌辐射类型α射线，穿透力差β射线，穿透力略强于α射线

γ射线，穿透力很强X射线，人工产生的电磁辐射电子束，可用于表面消毒（低能量）或内部消毒（高能量）电离辐射杀灭微生物的作用，可以分为直接作用和间接作用两种23第23页，课件共82页，创作于2023年2月辐射灭菌国外法规和指南ISO11737PDATechnicalReportNo.11PDATechnicalReportNo.16第24页，课件共82页，创作于2023年2月过滤除菌定义：除菌过滤是指除去流体中微生物的工艺过程，该过程不应对产品质量产生不良影响。包括液体和气体除菌过滤。药品生产中采用的除菌过滤膜的孔径一般不超过0.22um（或者0.2um，这两种标称没有区别）除菌级过滤器可以有不同的大小、形式和膜材，过滤器的使用者应当根据使用需要选择不同的过滤器。25第25页，课件共82页，创作于2023年2月过滤除菌除菌级过滤器是指在工艺条件下每cm2

有效过滤面积可以截留107CFU的缺陷假单胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146）的过滤器。影响细菌截留效果的因素过滤器源的因素，如过滤器类型、结构、基础聚合物、表面改性化学、孔径分布和过滤膜的厚度等工艺源的因素，如流体组分、流体性质、工艺条件，产品、料液和生产环境中实际微生物污染的特点和水平等26第26页，课件共82页，创作于2023年2月过滤除菌国外指南性文件PDATechnicalReportNo.15PDATechnicalReportNo.26PDATechnicalReportNo.40PDATechnicalReportNo.4127第27页，课件共82页，创作于2023年2月低温蒸汽灭菌气体灭菌与低温蒸汽灭菌的区别气体灭菌穿透性好，分布均匀，不易受到温湿度影响低温蒸汽灭菌，两个阶段的浓度不同，条件不易控制来自PDASterilizationTechnology28第28页，课件共82页，创作于2023年2月低温蒸汽灭菌灭菌剂的种类过氧化氢（HydrogenPeroxide，H2O2）过氧乙酸（PeraceticAcid-C2H4O3

）甲醛（Formaldehyde-CH2O）低温蒸汽灭菌的特点室温残留，穿透性低，环境中的温湿度会有差异，工艺的均一性不好29第29页，课件共82页，创作于2023年2月基本概念无菌(Sterility)：是指产品中不存在任何活的微生物。这个绝对的概念，无法用实验来证明，不能成为工业标准灭菌工艺(Sterilization)：通过适当的物理或化学手段，将一定数量的活性微生物完全杀灭，并且使其生命活动产生了不可逆转的过程。最终灭菌是最常采用的工艺，新版GMP附录已明确，不包括流通蒸汽灭菌无菌保证值（SAL）：指经灭菌后非无菌品的概率。通常为10-6或10-3（来自ISO11139）30第30页，课件共82页，创作于2023年2月31湿热灭菌的能量转移湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，尽管有时也采用过热水灭菌，如水浴式或喷淋式。蒸汽灭菌是一个高效的热传递方式，因为蒸汽接触温度较低的物体时，会释放潜热，生成冷凝水，直到物体温度与蒸汽温度相等。第31页，课件共82页，创作于2023年2月32湿热灭菌的热力学基础第32页，课件共82页，创作于2023年2月湿热灭菌工艺的无菌标准原则标准--定义通过物理/生物学方法证明，单位产品内微生物存在的概率不得超过百万分之一，即批产品的污染概率不得超过百万分之一实际控制标准过度杀灭法（F0≥12）残存概率法（F0≥8）Fo≥8最早在出现在USPXIXP709、BP1980A196中。不应当将Fo≥8简单地等同于无菌标准

33第33页，课件共82页，创作于2023年2月34USP-过度杀灭标准示意USP过度杀灭法

每瓶100万个芽孢，其D=1

杀灭到100后，再使其存活概率下降6个对数单位

标准灭菌时间Fo达12以上药典无菌标准

生物负荷及其D值均可能不同，在将其杀灭到100后，法规要求再使其存活概率下降6个对数单位—可理解为安全系数。SALlgN6543210-1-2-3-4-5-6024681012第34页，课件共82页，创作于2023年2月35湿热灭菌中的微生物死亡模式实验表明，在恒定的灭菌温度下，同一种微生物的死亡遵循一级动力学规则，其死亡速率是微生物的耐热参数D和杀灭时间的函数，与灭菌程序中微生物的数量无关。可用下面的半对数一级动力模式表示：LgNF=LgN0

-F(T,z)/DT

[等式1]NF灭菌F分钟后，微生物存活的数量F(T,z)灭菌程序在T℃和温度系数z下的等效灭菌时间DT微生物在T℃下，下降一对数单位所需的时间。说明：该特定温度必须与F值计算中所采用的温度相一致N0初始微生物的数量第35页，课件共82页，创作于2023年2月36无菌检查实验的局限性实验本身存在统计学局限性p,批产品的污染率；n，取样量批检验不合格的可能性=1-(1-p)n

取样量实际污染率0.1151015100.010.090.400.660.80200.020.180.650.890.96500.050.340.920.991000.090.630.993000.260.953,0000.95第36页，课件共82页，创作于2023年2月37湿热灭菌工艺决策树是热不稳定材料吗？按产品特性设计法采用过度杀灭设计法被灭菌品的形式？需考虑抽真空？现抽真空灭菌器？脉动真空程序重力置换程序否是多孔固体物品密封液体产品要过热水或SAMSAM程序任何湿热程序有无可不可可用过热水程序？要不要需加压吗？SAM：表示蒸汽及空气的混合物不要第37页，课件共82页，创作于2023年2月38药典要求EP对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为121oC×15分钟；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上述相等效。目标：SAL=10-6或更低第38页，课件共82页，创作于2023年2月39药典要求EP对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为121oC×15分钟；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上述相等效。目标：SAL=10-6或更低USP对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件需达到12D，至少为12分钟目标：使D121=1分钟，数量为106的微生物经过灭菌后达到SAL=10-6。第39页，课件共82页，创作于2023年2月40灭菌工艺的开发与设计根据灭菌前带菌量进行设计（产品特性设计法）基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的热稳定性灭菌后产品的污染概率须小于10-6。过度杀灭法基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上一定的安全系数；理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到10-12。将两者相结合兼顾产品的热稳定性和无菌要求。第40页，课件共82页，创作于2023年2月41EMEA灭菌工艺决策树（适用于液体制剂）能否耐受121℃×15分钟的湿热灭菌条件选择121℃×15分钟湿热灭菌工艺是否能否耐受F0≥8的湿热灭菌条件，以达到SAL≤10-6选择F0≥8的湿热灭菌工艺，以达到SAL≤10-6是否使用无菌过滤加无菌灌封方式是否能否经可截留微生物的过滤器对药液进行除菌过滤对原料预先灭菌，进行无菌配制和无菌灌封第41页，课件共82页，创作于2023年2月42灭菌工艺/程序的验证确认（IQ、OQ）灭菌设备的安装、运行符合设定的要求验证（PQ）产品灭菌程序的有效性和重现性评估灭菌过程中可能发生的各种变化给灭菌效果带来的影响，产品是否能达到药典规定的无菌保证水平第42页，课件共82页，创作于2023年2月43灭菌设备的IQ/OQ检查设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所有零部件均与采购技术要求（URS）相符；控制/监测仪表的校验，包括程序控制器、温度、压力和时间控制设备，以及计时器、记录测量仪等；试车–空载热分布试验（来自PDA技术报告草案）温度探头10-20支；探头精确度±0.5℃;须有探头与腔室原探头并列放置;检测报警和安全系统的可靠性;真空系统的可靠性(起的作用、保持时间等);灭菌温度下，各点间最大温差(腔室内)≤2℃；同一点的最大温差≤

±1.0℃;重复试验至少3次以证明具有重现性。第43页，课件共82页，创作于2023年2月44灭菌工艺的PQ每种装载方式下的热穿透试验证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性;证明灭菌程序的重现性和稳定性;证明灭菌程序对被灭菌物品的适用性。容器内部产品的热穿透试验证明在每种装载方式下：各点温度分布的均一性、灭菌结果的重现性;证明最冷点达到了设定效果。高中低第44页，课件共82页，创作于2023年2月45PQ常用BI形式生物指示剂试验结果与热穿透试验保持一致所有测试点均应确保SAL不低于10-6试验次数足以符合统计学要求（至少重复3次试验，试样数为10–20支/次）第45页，课件共82页，创作于2023年2月46灭菌设备的性能确认空载热分布和满载热分布试验（供参考）温度探头10-20支；探头精确度±0.5℃;必须有探头与腔室原探头并列放置;检测报警和安全系统的可靠性;真空系统的可靠性(产生的效率、维持时间等);灭菌程序一般选择121℃×20分钟；针对蒸汽透过型物品，在灭菌恒温段内，所有探头温度都在平均温度的±1.5℃以内；在任何时间各点最大温差不超过2℃；实际灭菌时间控制在期望值的±1%以内；实际灭菌压力控制在期望值的±1.6%以内；冷点位置固定;针对蒸汽不可透过型物品，在灭菌恒温段内，所有探头温度都在平均温度的±1℃以内；在任何时间各点最大温差不超过1.5℃；实际灭菌时间控制在期望值的±1%以内；其它各项性能指标均一;重复试验至少3次以证明重现性.第46页，课件共82页，创作于2023年2月47相关的术语无菌保证值（SAL）：指经灭菌后非无菌品的概率。最终灭菌产品非无菌品的概率不超过百万分之一，即SAL≤10-6D值：在一定温度下将微生物数量杀灭90%或下降一个对数单位所需要的时间（分钟）FT：指T℃下的灭菌时间F0：指标准灭菌时间。将121℃作为标准灭菌温度，当Z设定为10℃时，灭菌程序赋予被灭菌品121℃下的等效灭菌时间。第47页，课件共82页，创作于2023年2月48相关的术语-续灭菌率（L，LethalRate）公式：L(Tref,z)=10(T-Tref)/zT被加热的物体的实际温度Tref参照温度，通常取121℃z微生物的z值（可取10℃），指使微生物的D变更一个对数单位灭菌温度所需调节的度数用121℃和z取10代入，得L=1，即一个标准单位，其它温度下，可代入计算L公式推导：详见药品生产管理规范与质量保证（南京大学出版社1989年）附录三：湿热灭菌和无菌保证。第48页，课件共82页，创作于2023年2月49计算公式从L的公式推导，可得：

Fo/FT=D121/DT=L

Fo=D121×(logN0-logNt)从灭菌率的公式，可求得不同温度下的灭菌率（详见下页），当低于100℃时，L可忽略不计。F0=10(T－121)/Z

dt∫tnt0将介绍三个示例第49页，课件共82页，创作于2023年2月50不同温度和z值下的灭菌率T/(℃)Z＝7Z＝8Z＝9Z＝10Z＝11Z＝121000.0010.0020.0060.0080.0120.018…………………1150.1390.1780.2150.2510.2850.3161160.1930.2370.2780.3160.3510.3831170.2680.3160.3590.3980.4330.4641180.3730.4220.4640.5010.5340.562118.50.4390.4890.5270.5620.5930.6191190.5180.5620.5990.6310.6580.6811200.7200.7500.7740.7940.8110.8251211.001.001.001.001.001.001221.391.331.291.251.231.21第50页，课件共82页，创作于2023年2月51芽孢的特性芽孢是休眠体Endospore与Exospore形成芽孢的细菌种类芽孢的特性常用芽孢嗜热脂肪芽孢杆菌的内生孢子梭状芽孢杆菌成熟芽孢的电镜照片第51页，课件共82页，创作于2023年2月52适用于不同灭菌工艺的生物指示剂湿热灭菌法验证用生物指示剂，详见后述干热灭菌法验证用生物指示剂枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisv.niger)孢子，现称为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatropheus)孢子内毒素挑战去热原工艺验证替代生物指示剂验证

化学灭菌法验证用生物指示剂

嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)孢子第52页，课件共82页，创作于2023年2月53适用于不同灭菌工艺的生物指示剂辐射灭菌法验证用生物指示剂

短小芽孢杆菌(Bacilluspumillus)孢子

环氧乙烷灭菌用生物指示剂枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisv.niger)孢子，现称为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatropheus)孢子汽态过氧化氢（VPHP）灭菌用生物指示剂

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)孢子梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)孢子枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)孢子第53页，课件共82页，创作于2023年2月54湿热灭菌验证常用的BI在过度杀灭程序的确认中，最常采用BI：嗜热脂肪芽孢杆菌/Geobacillusstearothermophilus，前称Bacillusstearothermophilus；也可采用其他对湿热灭菌耐热性强的微生物。在采用“残存概率法”确认中，典型的BI有：Clostridumsporogenes（生孢梭菌，梭状芽孢杆菌

）Bacillusatrophaeus（萎缩芽孢杆菌）Bacillussmithii（史密氏杆菌，前称凝结芽孢杆菌）Bacillussubtilis（枯草芽孢杆菌5230）第54页，课件共82页，创作于2023年2月55常用BI的D值范围菌种名称D121值范围(min)嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus1.5-3.0枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis0.3-0.7凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans0.4-0.8梭状芽孢杆菌Clostridumsporogenes0.4-1.0第55页，课件共82页，创作于2023年2月56ISO标准的有关规定热稳定产品适用的菌种有G.stearothermuphlus或本ISO11138其它部分所要求同样性能的微生物。例如GeobacillusstearothermophilusATCC7953(5230)，…ATCC12980等注Bacillusstearothermophilus已重新命名为Geobacillusstearothermophilus.热稳定性较差的产品：低于121℃，如不用Geobacillusstearothermophilus，可用BacillussubtilisATCC35021(5230)，但需测试其耐热性第56页，课件共82页，创作于2023年2月57ISO标准的有关规定接种的载体及BI，活菌数应≥1.0×10E5耐热性可以121℃下的D值表示。每批BI或其已接种的载体的D值，应以121℃下的分钟数表示，至少应至小数点后的一位。已接种悬浮液或载体的D121应≥1.5分钟。如果是其它菌种，则应有D参数的相关技术。…微生物的z应有3个点，温度范围在110℃~130℃间，z值应≥6℃。第57页，课件共82页，创作于2023年2月58灭菌程序杀灭力的表述生物杀灭力（FBiological）用以证明灭菌程序杀灭效果的标准BI制剂试验结果可直接反映灭菌效果有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入)局限性：较难进行统计学分析物理杀灭力（FPhysical）长期的试验确立了标准灭菌时间Fo与微生物杀灭的效果的相关性，因此，人们常将它作为评价标准精确测定热分布和热穿透状况，用于计算不同灭菌程序的灭菌效果测量数据便于统计学分析第58页，课件共82页，创作于2023年2月59灭菌程序PQ合格标准物理确认的合格标准(示例)如下：用热穿透探头测得超过设定温度的最短及最长时间F0的下限及上限；灭菌阶段结束时的最低F0值灭菌阶段的最低和最高压力饱和蒸汽温度和压力之间的关系灭菌阶段腔室的最低和最高温度热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围热分布试验中温度探头间的最大温差最长平衡时间；最少正常运行的探头数第59页，课件共82页，创作于2023年2月60灭菌程序PQ合格标准-续生物确认合格标准（示例）：微生物挑战试验中，孢子的对数下降值符合预期标准规定的阳性和阴性对照符合设定要求应在灭菌程序性能确认中进行必要的论证，证明FPHY和FBIO间大体上一致（基本一致：F生物可能小些，F物理可能大些）

第60页，课件共82页，创作于2023年2月61BI验证-过度杀灭工艺选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂，最常用的是（B.stearothermophilusATCC7953，D121=1.5-2.0分，接种量10E5–10E6个孢子）生物指示剂与温度探头并列在同一部位(10-20支)按规定条件培养生物指示剂，如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为55-60℃，培养7天，每天检查。对生物指示剂用培养基进行促菌生长检查进行阳性对照试验所有经挑战试验的样品均呈阴性第61页，课件共82页，创作于2023年2月62BI验证–残存概率工艺残存概率的灭菌工艺中，产品的污染水平及其耐热性是灭菌终点的决定性因素。…应将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是依赖最终灭菌去消除污染。选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的BI生物指示剂的耐热性不得低于孢子在相应产品中的耐热性不得低于产品中污染菌的耐热性用于每次挑战试验的所有BI批号必须相同.BI接种量的计算：Fo

=D121.×(lgN0-lgNt)上式中，Fo、D121、lgNt（药典标准）均已知，只需计算N0第62页，课件共82页，创作于2023年2月63液体装载灭菌程序的确认为了对液体装载进行BI确认，在密封的、灌封液体的容器和密封件上要接种适当的BI。液体介质可用产品或适当的代用品。如果液体产品含有防腐剂或其他抗生素成分，…，可能有必要用液体替代品作为悬浮剂。使用何种产品作为悬浮剂需要有试验数据的支持，证明它们不抑制微生物的生长。BI通常被随机地或以几何模式放置在整个装载区的容器中，包括开发阶段确定的冷点位置。热穿透试验探头应放置在接种的容器或其旁侧，以监测灭菌程序的热输入情况。第63页，课件共82页，创作于2023年2月64多孔/坚硬装载程序的确认多孔/坚硬装载生物指示剂确认中所用的生物指示剂主要由市场购得，它们可以放置在纸上、不锈钢、铝或其他基质上。另一种可选的方式，是将孢子接种在设计的试样上。密封在安瓿中的生物指示剂可能并不能反映多孔/坚硬装载的实际情况。将BI挑战系统放置在物品加热最慢的部位--最难灭菌的部位。例如，这些部位可能存在于筒式过滤器的褶皱中，或者在长软管的中部（那里可能夹带空气），或者在蒸汽难以穿透的橡胶塞与瓶的密封口上。第64页，课件共82页，创作于2023年2月65BI验证中常见的问题BI无出厂证或证书不符合要求供货商不提供每个单元中的BI数量无耐热性数据BI验证的实测结果与理论计算相差太大市售BI的耐热性高，产品不能经受过度杀灭，企业不知道如何接种初始菌量许多人不知如何计算，如何评估第65页，课件共82页，创作于2023年2月66BI初始量及D值的确定PDATRNo12007提出以下公式：LgNF=LgN0-F(T,Z)/DT，即LgN0=LgNF＋F/D（见第52页幻灯片中的等式1）F灭菌程序设计期望获得的杀灭力/灭菌时间D挑战试验中BI的耐热性N0

挑战菌的起始浓度（接种量）NF灭菌程序结束后，挑战菌的存活数量。为了方便计算，如果将挑战菌全部杀灭，可以认为存活数小于1，在此等式中，可取NF为10E0表示。第66页，课件共82页，创作于2023年2月67孢子液的使用要求孢子在标准溶液中的耐热性≥孢子在产品溶液中的耐热性孢子的耐热性在标准溶液中比较稳定有孢子在标准溶液中的耐热性资料标准溶液更方便于制备和检测适用于替代灭菌程序相近的不同产品的灭菌工艺验证生物指示剂的D值测定方法（另文）第67页，课件共82页，创作于2023年2月68实例分析第68页，课件共82页，创作于2023年2月691.

D值的测定实例分析第69页，课件共82页，创作于2023年2月D值的影响因素物理、化学条件、环境因素、湿度，如：孢子所处的介质、测试温度、内包装材料灭菌时间（由加热和冷却滞后所致的影响）加热和培养计数之间的温度、时间和环境条件用来培养计数灭菌后孢子的培养基等芽孢是否处于被包裹状态，此状态会使其耐热性大大增强微生物的耐热性（或统称对灭菌剂的耐受性）70第70页，课件共82页，创作于2023年2月D值的影响因素-续影响微生物的耐热性因素还包括：在氯化钠或氯化钾存在条件下，G..嗜热脂肪杆菌的耐热性会增强；在二价钙离子和镁离子存在时，B.凝结芽孢杆菌的耐热性也会增强；在钾离子存在的情况下，C.梭状芽孢梭菌的耐热性会增强鳌合剂的存在（如柠檬酸）也会影响耐热性，强鳌合剂可以竞争性作用周围的离子，使包衣式芽孢的耐热性产生变化。在接种的载体上（例如纸或橡胶），也可观察到相似的耐热性差异。……71第71页，课件共82页，创作于2023年2月DT值的确定方法DirectEnumerationMethod直接计数法

又称SurvivalCurveMethod残存曲线法FractionNegativeMethod阴性分数法

-Spearman-KarberMethod史丕曼-卡伯法

-Stumbo,Murphy,andCochranMethod

第72页，课件共82页，创作于2023年2月D值测定仪器Biological

Indicator—EvaluatorResistometer(简称BIER/Vessel)油浴装置–用于残存曲线法

第73页，课件共82页，创作于2023年2月D值测定仪器的典型温度曲线温度时间(分钟)第74页，课件共82页，创作于2023年2月残存曲线法测定D值仪器及材料油浴（适宜的温度范围，精度，容量）毛细管与支架试验用芽孢悬浮液准备工作悬浮液占试验悬浮液比例不超过10%每0.05ml