液相色谱培训

液相色谱培训第1页，课件共56页，创作于2023年2月一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分第2页，课件共56页，创作于2023年2月液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力

液相色谱基础知识第3页，课件共56页，创作于2023年2月HPLC的分离类型正相色谱(NP-HPLC)反相色谱(RP-HPLC)反相离子对色谱(RPIC)离子交换色谱(IEC)空间排阻色谱(SEC)手性化合物分离模式(Chiralseparationmode)第4页，课件共56页，创作于2023年2月液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱反相色谱化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序第5页，课件共56页，创作于2023年2月正相HPLC色谱柱硅胶型

氰基型

氨基型

糖类分析二醇基型蛋白质分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi第6页，课件共56页，创作于2023年2月反相HPLC色谱柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty第7页，课件共56页，创作于2023年2月

色谱柱

: 非极性溶剂 : 极性水

/甲醇

/乙腈反相色谱第8页，课件共56页，创作于2023年2月液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理第9页，课件共56页，创作于2023年2月流动相流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序第10页，课件共56页，创作于2023年2月溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率第11页，课件共56页，创作于2023年2月水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现第12页，课件共56页，创作于2023年2月溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.22um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱第13页，课件共56页，创作于2023年2月甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图溶剂等级第14页，课件共56页，创作于2023年2月溶剂前处理过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类水系过滤膜有机系过滤膜第15页，课件共56页，创作于2023年2月30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格。处理样品体积为7µl。样品过滤头的类型：第16页，课件共56页，创作于2023年2月滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。第17页，课件共56页，创作于2023年2月溶剂前处理

脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小气泡对测定的影响：

1）柱压波动，流量偏小

2）基线波动

返回第18页，课件共56页，创作于2023年2月流路中形成气泡引起的问题

改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声第19页，课件共56页，创作于2023年2月输液泵输液泵控制方式：恒流控制恒压控制输液泵类型：注射泵柱塞往复泵隔膜泵第20页，课件共56页，创作于2023年2月柱塞往复泵单向阀马达和凸轮柱塞杆柱塞杆密封圈泵头10-100uL第21页，课件共56页，创作于2023年2月柱塞往复泵优点压力脉动小易于更换溶剂缺点需要更换柱塞杆密封圈第22页，课件共56页，创作于2023年2月岛津VP系列输液泵目的单元流速范围 特性和应用

分析

LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于

半微量LC和LC-MS

LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性，适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度第23页，课件共56页，创作于2023年2月等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂第24页，课件共56页，创作于2023年2月梯度洗脱

A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B

浓度第25页，课件共56页，创作于2023年2月分析时间长分离度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脱第26页，课件共56页，创作于2023年2月95%30%MeOH浓度梯度洗脱第27页，课件共56页，创作于2023年2月梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）第28页，课件共56页，创作于2023年2月混合器低压梯度比例阀高压梯度低压梯度脱气机高压/低压梯度系统第29页，课件共56页，创作于2023年2月返回高压梯度系统梯度准确度好系统复杂(需两台或三台泵)低压梯度系统系统简单需在线脱气机存在时间滞后效应高压/低压梯度系统第30页，课件共56页，创作于2023年2月进样器自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入返回第31页，课件共56页，创作于2023年2月手动进样器的原理图

装填状态进样状态返回第32页，课件共56页，创作于2023年2月进样体积检测器响应值定量管体积的一半3倍定量管体积全量注入部分注入进样体积与响应值关系返回第33页，课件共56页，创作于2023年2月柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：第34页，课件共56页，创作于2023年2月色谱柱1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）流动相PH使用范围为2～7.5返回ODS柱的使用注意点：第35页，课件共56页，创作于2023年2月流动相注意点离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用分析结束及开始流动相平衡加快平衡时间异丙醇的使用第36页，课件共56页，创作于2023年2月LC检测器紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器（PDA）示差检测器（RID）电导检测器（CDD）荧光检测器（RF）电化学检测器（L-ECD）质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器（ELSD）

第37页，课件共56页，创作于2023年2月紫外可见检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL优点：1）对温度和流速变化不敏感

2）可用于梯度分析缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外可见检测器第38页，课件共56页，创作于2023年2月样品池参比池光电管光电管EinEinEin光栅D2/W灯lEout紫外可见检测器第39页，课件共56页，创作于2023年2月岛津VP系列紫外检测器功能1）设定时间程序（波长切换等）2）双波长检测3）比例色谱，初步判断峰的纯度4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长NEXT第40页，课件共56页，创作于2023年2月波长切换返回第41页，课件共56页，创作于2023年2月双波长检测返回第42页，课件共56页，创作于2023年2月比例色谱280nm220nmratio280/220返回第43页，课件共56页，创作于2023年2月波长扫描返回第44页，课件共56页，创作于2023年2月二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）二十一世纪标准紫外检测器色谱信息：保留时间常规紫外检测器紫外光谱二极管阵列检测器第45页，课件共56页，创作于2023年2月样品池二极管阵列（512个单元）光栅D2/W灯每一单元可检测一个波长下的吸光度二极管阵列检测器第46页，课件共56页，创作于2023年2月三维谱图时间波长吸光度色谱光谱第47页，课件共56页，创作于2023年2月二极管阵列检测器的优点1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索NEXT第48页，课件共56页，创作于2023年2月峰纯度检验（3点光谱图比较）InitialdetectionpointFinaldetectionpointT1T3T2peaktopupslopedownslope1/21/3第49页，课件共56页，创作于2023年2月乙酰水杨酸下降点上升点,顶点峰纯度检验（3点光谱图比较）返回第50页，课件共56页，创作于2023年2月光谱库检索返回第51页，课件共56页，创作于2023年2月检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定试样各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度和压力变化敏感

2）不能用于梯度分析示差折光检测器返回第52页，课件共56页，创作于2023年2月糖的色谱图AnalyticalConditionsColumn:Shim-packCLC-NH2Mobilephase:Acetonitrile/water=7/3Flowrate:1.0mL/minTemperature:AmbientPeaks1.甘油

2.木糖

3.果糖

4.葡萄糖

5.蔗糖

6.甘露糖

7.乳糖第53页，课件共56页，创作于2023年2月荧光检测器原理:基于被分析组分发射的荧光强度进行检测缺点:仅适用于测定可产生荧光的物质优点:1)灵敏度极高,是最灵敏的检测器之一

2)选择