《烤烟品种鉴定技术规程 SSR分子标记法》编制

编制说明中国农业科学院烟草研究所2023年5月

目录1工作简况 工作简况1.1任务来源烟草行业推荐性标准文件《烤烟品种鉴定技术规程SSR分子标记法》是国家烟草专卖局2018年度下达的行业标准制订项目（国烟科[2018]177号）。项目类别：YC/T，合同号2018B007。该项目为标准制订项目，归口农业分标委。1.2项目承担单位、协作单位及主要分工本项目由中国农业科学院烟草研究所牵头承担，国家烟草基因研究中心、云南省烟草农业科学研究院、贵州省烟草科学研究院、湖北省烟草科学研究院、湖南省烟草科学研究所、江苏中烟工业有限责任公司、湖南中烟工业有限责任公司为协作单位。中国农业科学院烟草研究所负责项目技术路线以及技术方案的制定与实施；国家烟草基因研究中心、云南省烟草农业科学研究院、贵州省烟草科学研究院、湖北省烟草科学研究院、湖南省烟草科学研究所、江苏中烟工业有限责任公司、湖南中烟工业有限责任公司负责分子标记验证，参与标准制订。1.3主要工作过程1.3.1前期研究工作中国农业科学院烟草研究所长期承担烟草遗传育种理论方法和新品种选育研究，是全国烟草品种协作网及行业烤烟新品种区域试验和农业评审的牵头组织单位，具有较好的学科优势和工作基础。2010年，由中国烟草总公司青州烟草研究所（中国农业科学院烟草研究所）起草，国家局发布了国内首个烟草DUS测试标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟》（YC/T369-2010），该标准列举了40个测试性状，包括35个基本性状，其中16个为必测性状，以及5个选测性状。同时发布了35个标准品种供DUS测试时进行性状代码判别。烟草DUS测试以表型鉴定为基础，周期长、成本高，鉴定结果容易受环境影响，并且不同测试人员对性状的认识存在一定偏差，也会引起性状代码判定结果的不一致。针对上述问题，青州所近年来加强了以分子标记技术、烟草品种分子指纹图谱为基础的分子检测技术的研发。开发了烤烟DUS测试标准品种的指纹图谱，发表SCI研究论文1篇：“BinbinHe,etal.,BMCPlantBiology，2020，20:378”；完成了雪茄烟品种的SSR和SNP分子标记指纹图谱，发表研究论文2篇：“YanyanWang，FrontiersinPlantScience，2021，DOI:10.3389/fpls.2021.618133”、“王琰琰等，作物学报，2021，47(7):1259-1274”；授权相关发明专利2项，分别是：“一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用（ZL201510227440.5）”、“一种烤烟SSR核心引物组合及其构建方法（ZL201610547721.3）”；出版相关著作2部：《中国烟草核心种质资源图谱》（发布了烟草核心种质资源的SSR指纹图谱）和《海南雪茄烟种质资源SNP指纹图谱及身份证》。1.3.2项目启动根据标准合同确定的项目范围、主要内容和项目技术方案，对项目组进行分工部署，制定项目工作计划，提出各阶段工作目标。1.3.3分析数据、开展实验，拟定初稿利用33份烤烟DUS测试标准品种为本标准的参照品种，并进行了SSR标记筛选，发掘候选SSR标记，开展最小引物数研究，形成了烤烟品种鉴定SSR分子标记体系，绘制了参照品种的分子指纹图谱。总结项目研究成果，形成《烤烟品种鉴定技术规程SSR分子标记法》（初稿）。1.3.4征求意见项目组结合相关数据和试验验证总结，对标准初稿进行修改完善，形成了标准征求意见稿。拟在国家烟草专卖局内网和中国烟草标准化研究中心网站征求意见，并由项目牵头单位向行业单位发函广泛征求意见。1.4标准主要起草人及其所做的工作暂略2相关领域的国、内外标准研究和制修订情况植物新品种在农业增产、增效和社会经济活动中起着至关重要的作用，对植物新品种实施知识产权保护，是当今国际通行的做法和人类文明进步的标志。开展新品种保护离不开一系列技术条件的支撑，其中新品种的特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）测试就是植物新品种保护的技术基础和科学依据。1999年我国正式加入《国际植物新品种保护公约》，成为国际新品种保护联盟（InternationalUnionForTheProtectionOfNewVarietiesOfPlants，简称UPOV）的成员国。随后以UPOV的DUS测试指南为范本，制定了一系列适合我国特点的农作物DUS测试指南，并在植物新品种保护方面推广应用。2017年5月1日起实施的《非主要农作物品种登记办法》第十二条明确规定，申请登记的品种应当具备特异性、一致性、稳定性。在国际上UPOV于2002年首先发布了烟草DUS测试指南，随后我国学者依据《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T19557.1-2004），同时参考UPOV的测试指南制定并发布了我国首个烟草DUS测试标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟》（YC/T369-2010）。为我国开展烤烟新品种实质审查测试工作、正确授予烤烟新品种权提供了重要依据和技术保证。到目前为止，国内外尚未查询到有关基于SSR分子标记的烤烟品种鉴定技术标准。随着DNA分子技术的快速发展，分子检测技术凭借其测试周期短、不受环境影响、易于自动化等优势，已逐步应用于多种农作物标准品种的指纹图谱构建及DUS测试中。2013年，农业部发布了《小麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法》（NY/T2470-2013）；2014年，农业部发布了《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》（NY/T2594-2014），规定了植物品种DNA指纹鉴定的基本原则、通用方法及判定标准，并于同年发布了《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T1432-2014）、《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T1433-2014）、《大豆品种鉴定技术规程SSR分子标记法》（NY/T2595-2014）等农业行业标准；2016年，在深入调研、收集资料、样品测定与试验验证的基础上，农业部发布了《植物品种鉴定DNA分子标记法总则》（NY/T2594-2016），替代《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》（NY/T2594-2014）并于2016年10月1日起实施。项目组在标准制订时，对上述标准进行了深入的调研分析，进行一定程度地借鉴和参考，某些共性的内容尽量与上述标准保持一致，体现标准之间的协调一致性。3标准编制原则及主要内容确定的依据3.1标准适用范围本文件规定了利用简单重复序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）标记进行烤烟（NicotianatabacumL.）品种鉴定的操作程序、结果统计和结果判定。本文件适用于烤烟品种SSR指纹数据采集和品种鉴定。3.2标准编制原则《烤烟品种鉴定技术规程SSR分子标记法》的编制遵循“科学、实用、合理”的原则，力争做到应用可行、技术适用、实施科学，既起到指导和规范烤烟品种鉴定，又服务于烟草新品种选育的作用。3.3标准主要内容确定的依据3.3.1范围的确定紧密围绕烤烟品种分子标记鉴定技术的特点和相关标准技术内容，合理规定了标准要求的内容和适用范围。3.3.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则3.3.3术语和定义术语内容的确立，是通过综合调查资料，项目组成员共同研讨而确定，既立足术语本身又紧密结合本标准的实际特点。3.3.4鉴定流程和技术要求3.3.4.1原理简单重复序列（SimpleSequenceRepeats,SSR）是指DNA（Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸）分子中1~5个核苷酸的串联重复。真核生物的基因组中散布着大量的SSR，它们具有丰富的多态性，并能按照孟德尔方式稳定地遗传和分离。SSR是一种较理想的分子标记，它具有以下优点：多数为共显性遗传，可以检测纯合基因型和杂合基因型；变异类型丰富，多态性高；在整个基因组中随机分布；可通过PCR迅速测定分析；所需DNA量少，且对质量要求不高。因此，该技术一经问世，便很快在动植物的遗传分析中得到了广泛应用。在烟草中，不同烤烟品种基因组中SSR的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及各类电泳方法进行检测，进而区分不同的烤烟品种。3.3.4.2参照品种本标准选用的参照品种为《YC/T369-2010植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟》的标准品种，共计33份（表1），保障了标准之间的连贯性。表1.本标准的参照品种编号资源编号品种名称资源类型典型性状SV012290NC82引进椭圆形叶形SV02485小黄金1025地方叶数少、黑胫病感病SV031084G28引进叶宽宽、叶长宽比小、宽椭圆形叶形、感CMVSV042490中烟90选育纵向叶面急弯、叶面较皱、叶缘皱折SV051365中烟15选育花序密集SV062243Coker176引进叶耳大、中等花冠尖SV072293NC89引进叶厚较厚、横向叶面平、叶面平整、叶色绿SV082266K326引进株型塔形、腋芽少、长椭圆形叶形、叶尖渐尖、横向叶面凹、纵向叶面微弯、波浪叶缘、花色淡红SV093660中烟100选育叶缘微波、花长短SV10540红花大金元选育叶面平整、花冠小、花色红SV11503革新三号选育抗黑胫病、中抗TMVSV12520净叶黄选育抗赤星病SV134820中烟103选育叶缘皱折SV142318G140引进感赤星病、感TMVSV151087T.I.245引进抗CMVSV163570Coker139引进腋芽少、倒圆锥形花序SV173765K149引进叶宽窄、叶色浅绿SV18494金星6007选育中抗黑胫病SV19258长脖黄地方叶长长、叶长宽比大、叶尖钝尖、感青枯病SV20505革新五号选育株高很高、叶数较多SV213574NC-22-NF引进株高很高、叶数多、叶长短、中心花开放很晚SV222339丸叶引进有叶柄、茎叶夹角大、宽卵圆形叶形SV231020DB101引进抗青枯病SV242299NC矮杆种引进株高矮SV253780NC27NF引进株高高、叶数多、中心花开放晚SV262247Coker254引进主茎色浅绿SV272291NC86引进主茎色深绿、叶尖急尖、叶色深绿SV282282MN373引进叶厚较薄、长椭圆形叶形、叶耳小、中心花开放早SV291005B.L.Orinoco引进长卵圆形叶形SV30484小黄金5209地方卵圆形叶形SV313750Coker371Gold引进花管膨胀部不明显、SV322340泰国白花烤烟引进花色白SV333719贵烟11号选育球形花序3.3.4.3引物筛选本研究采用的SSR位点来自烟草高密度SSR遗传连锁图谱，并从前期研究中挑选多态性较高、带型清晰且扩增稳定的340对标记作为本研究的供试标记。利用340对SSR标记对33份参照品种进行了扩增检测，筛选扩增效果良好的候选SSR标记。共筛选到103对扩增带型清晰且具有多态性的SSR标记。UPGMA聚类分析结果表明，利用103对SSR标记可以完全区分33份参照品种。3.3.4.4最少引物数评估为评估可用于解析遗传差异的最少引物数，本研究基于上述103对标记，及其所揭示的遗传多样性数据，利用随机抽样的策略，比较并分析了不同标记数量的样本间，遗传多样性变化的规律。从一次随机抽取1个标记到一次随机抽取90个标记，每种标记数量均重复试验50次，计算每次抽样反应遗传多样性程度的平均PIC值，并绘制成散点图（图1）。从图中可知，随着标记数量的增加，代表PIC值的散点越趋向于PIC平均值。反映在变异系数（CV）上（图中下方的直方图），抽样的标记数量越多，重复间的变异系数越小。根据变异系数直方图的趋势线计算可知，当标记数量达到25个时，变异系数开始小于5.0%，说明PIC值的变化已经趋于稳定，因此揭示烟草品种的遗传多样性水平，最少可用25对SSR标记。图1.不同SSR位点数抽样实验的PIC值及其变异系数。注：X坐标轴为抽取的SSR标记的数量，Y主坐标轴为PIC值的变异系数，在图中用柱状图展示；次坐标轴为各次抽样的PIC值，在图中用散点图展示。随着标记数量的增加，代表PIC值的散点越趋向于PIC平均值，重复间的变异系数逐渐变小。3.3.4.5构建供试群体的SSR标记指纹图谱从103个供试SSR标记中，按每条连锁群2个标记的原则，选择了48对SSR标记（见表2），用于构建参照品种的指纹图谱。利用以上48对标记不但满足最小引物数的要求，聚类分析结果表明，亦可完全区分33份参照品种。表2.48对SSR引物的名单及序列引物

编号引物

名称连锁群上游引物序列（5'→3'）下游引物序列（5'→3'）F01PT50862LG1ATGCGCTATGTTGGCTTCTTTCAAAGTGCAATGTGTTCGCF02PT51665LG1CCCGTAATACATAAATGGAAGAGCGCATACCACCTGCCTTACCTF03PT55027LG2AAATTAACGCTCTTTCGTCTGAACGTCACATGAATAATCACAATCAAF04PT60122LG2GGGAAAGTTACACAGTGCCCGCCTTCCACTCAAACAAATAGCF05PT30202LG3TCGAAACCTCGAGGACAGTTTATCCAAATCTCCAAAGCCCF06PT60080LG3CTACGCAGAATCCAATTCCACATTAGGCCATAGCCATCCAF07PT53970LG4TCATTGGTTCCTCGTCCTTTAAGACAACTCCTTCACCATTCAF08PT53100LG4ATACGGGCTTCCCAGGTAACAATCCCTTATCCTTTGTGTCAAF09PT61414LG5AAAGAAAGGAGGCATGCAAACAATGACTAATAGAATCGGTTACAGGF10PT61187LG5GCTCAGTCGTGAAGAAACAGAAAGGGAATCCTTGGTTGGTTTF11PT60650LG6CGGGAGCACCATTATCAAATGTCATCGATCCCGCATAACTF12PT61154LG6TCGCCTCCTAATTACTCTTCTGAAAAGGGCCAACCCTGATATTF13PT50599LG7GCGAACCTTTGAACCAGTCTAAACGCCTAGGCAGAACTCAF14PT30165LG7ACCTCTGTGGCCGTAAGCTACCTCTACTTCAACAGGGTAAGAAAF15PT51206LG8CAAGGGAATGGAACTGATGAAAAGGCGTTCGGTCTGTATTGF16PT61279LG8CTCACACCCATTTGTTACCGGGCGACAATGTTGTTGTGTCF17PT60917LG9CAGGAGACTCCATAAATTCACTCTTAGCATGGTTGCTATTGGCTGF18PT50392LG9ATTACAACCACTGCGAAACGGCTAAGCAAAGAGAGGTGCCF19PT51144LG10ACCGACAACACACGATTGTAGCTTGTCGCTTAGCTTAACCATF20PT54061LG10CAACGTGTGCCGAAAGACTATTGGGAACGTGAGGGATATGF21PT30024LG11GTAGATGGGAGAGCCACGTCAAAGGAGGTAAATTGCAGCGF22PT53036LG11TGCGTTCCAACTCTTATCCCAAATATTTCGCGGACATGGTF23PT52958LG12TGACACATAGTTCAGCCATCAATGGTTCTATATTTCTGACGGGAF24PT51896LG12CTTCCCTCTGTAACAACGCCAACAGTTTCAATTATAACACTGCCAF25PT55289LG13ACTTGAAGCCGTTGTTGCTTGCACGGCAATACCTTTGTGF26PT53829LG13CCTCCATTGACATGTGACGAAATGCCAAGCTGAGGTTTGTF27PT60868LG14AACTCACGTTCCCTTTGCCCAATCACCAATGAATGGAACCF28PT53953LG14CATAATTTATTCGTGAAATGATGCAGAATATGCACTTTGCGGGTF29PT30272LG15GAACCTAACCTCGCTCCACAAAATGGTAGCTGCGAGGAGAF30PT54772LG15TCAGCTCCTCCTTTCTCCTGCTTACAAATTTCGCCTCGGTF31PT20275LG16GTTCTATTTGATCGCCCCAACAGCACCAACAGCATTF32PT53227LG16CCAAATAATCTTCATATTGATCCGCGAGAAAGGAGGAGTTGCATF33PT51364LG17CCTTCTTGAACTTCGTGCGTTGCTCTCTAATTTCCATGTTCAGAF34PT54169LG17CCGTGCGTTACAATCCTTCTAAGGTTGAAACACAATATCTCCAF35PT51415LG18AAAGCTTAAGCAAAGAGCTGACAGAATGTTCAATTTCAGATATGGCF36PT60716LG18TTGTAAGCCTATGACACCACCTTACTATCGGTGGATTAGCCCGF37PT53770LG19CAGAATTTCCCTTCCACAGAACATCGTAAGCGTCAGTCTGCF38PT53519LG19GCTTGGCATCATCAGAATTTTATTTCCATTGGCCGTGTCTF39PT52111LG20AGGAATTGTCACATGAATCGGCAACAGTTTGGTTCCCAAGGF40PT52821LG20GGGCAATGGAGCAATAGAAATGCTTAAAGATTTCCACTCGTTF41PT51289LG21GAGTTGTGGCCAAGTAGCCTGGCTTTAGCCAAACGCTCTAF42PT52133LG21AAAGTGTGTTGTGTCTGGCACCCGGTTAAACTCCACTAATCAF43PT54196LG22CCTATGTTTGGAGCAGAGGGGTCATTGTCTGTGCATGGCTF44PT51152LG22GCGCAGTATTTAGCCCAACTCATTCCATCACAAGCTTCCAF45PT60152LG23CTTGCCAATCGTTCCTTCATCGGAACAAACGAGACTGTTAGAF46PT53595LG23CTTAGGACCCAAGAACCCAATCCATTCTTGTCCAAGGAGCF47PT53089LG24GCATTAGAGAGTGCGACATCACCCAACGTGAGGGATTACTTF48PT52828LG24TGAATTATGCGGTGCACATTATATTCCAACGTGGGCTGAA3.3.4.6烤烟品种鉴定SSR分子标记技术体系的建立本研究进一步根据扩增带型为每个标记的等位变异筛选了参考品种，共选择了32份参考品种。利用该48对SSR标记进行烤烟品种鉴定时，可加入