抗老年性痴呆药物筛选与评价

抗老年性痴呆药物筛选与评价1第1页，课件共81页，创作于2023年2月老年性痴呆的介绍研究老年性痴呆常用的动物模型研究抗老年性痴呆药物的主要方法主要内容2第2页，课件共81页，创作于2023年2月又称阿尔茨海默病（Alzheimer‘sDisease，AD），是老年人最常见的一种病因不明的大脑退行性变性病，是引起痴呆最常见的病因。患者多发病于50岁前后，女性多于男性（约1.5～2:1）。早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退，并会出现性格和行为的改变。在65岁以上的人群中，大约10%患有该病，全世界约有2400万患者。目前没有准确诊断和有效治疗的方法。老年性痴呆3第3页，课件共81页，创作于2023年2月AloisAlzheimerAD的历史AugusteDeter1906阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性痴呆表现的51岁女性患者。当医生给她看一个物体时，她最初能够说出这个物体的正确名称，重复几次都是一样，但是以后突然间，她把一切都忘掉了。当阅读一本书时，她可能无缘无故地跳过一些句子，她也许会一个字母、一个字母地拼读每一个字，也许会读起来完全没有抑扬顿挫。在书写测验时，她会反复书写同一个音节，而完全忽略其他的音节，因而变得完全错乱，六神无主。当她讲话时，常常是使用杂乱无章的词句，应用似是而非的表达方式。有时，在说话时会突然停下来，一言不发。不能理解向她提出的任何问题。找不到回自己住处的路。病情逐渐恶化，四年半后死亡。患者死后病理检查显示：大脑皮层萎缩，神经原纤维缠结。其后，又有类似的病例报道。因其发病于老年前期，早期认为这是一种和老年性痴呆不同的疾病，于1910年把这种病命名为阿尔茨海默病。4第4页，课件共81页，创作于2023年2月AD的分类AD分为家族遗传性（FamilialAlzheimer’sdisease,FAD)和散发性（SporadicAlzheimer’sdisease,SAD）FAD分为早发型（Earlyonset，多发病在40-60岁）和晚发型（LateonsetAD，LOAD多发病在65岁以上)APP：是第一个在早发家族性AD家系中被发现，定位于21q21.1-21.3，含19个外显子，其中第16和17外显子编码的APP水解片段Aβ被证实为AD患者脑中SP的主要成分。PS1/2：PS1基因定位在14q24.3上，含467个氨基酸残基；PS2定位在1q41.2上，含448个氨基酸残基，PS1基因有100多个突变与常染色体显性遗传早发性AD有关，只有7个这样的突变在PS2基因被发现。Tau：Tau蛋白基因位于17q21，包括16个外显子。在中枢神经系统2、3、10外显子间不同mRNA的剪接，表达6种Tau蛋白的同功异构体。ApoE：在第19对染色体上，ApoE基因的多态性与AD有着密切关系。在ApoE2,3,4等位基因中，ApoE4等位基因型是AD最主要的危险因素，主要与晚发型的散发性和晚发型家族性AD有关。5第5页，课件共81页，创作于2023年2月年龄是一个主要的危险因素

年龄患病率

65-74＝3％

75-84＝18.7%85+

＝47％年龄是AD发生的主要危险因素6第6页，课件共81页，创作于2023年2月From2000-2007,Alzheimer’sDiseaseDeathsIncreased50.6%while…Deathsby:HIV–declined22.0%Stroke–declined18.9%HeartDisease–declined13.3%ProstateCancer–declined6.4%BreastCancer–declined3.1%Alzheimer’sDiseaseHIVStrokeHeartDiseaseProstateCancerBreastCancerAD的发病率7第7页，课件共81页，创作于2023年2月阶段智能测验说明症状说明平均期间退化程度一（MMSE：29-30）正常-成人二（MMSE：29）正常年龄之健忘，与年龄有关之记忆障碍（忘记东西放置的地方及某些字，减少注意力）-成人三轻度神经认知功能障碍（MMSE：25）降低从事复杂工作之能力及社会功能（例如：完成一件报告）-年轻之成人四轻度阿兹海默氏失智症（MMSE：20）计算能力下降（100-7,40-4），无法从事复杂活动（个人理财、料理三餐、上市场），注意力、计算及记忆障碍（近期为主）2年8岁-青少年五中度阿兹海默氏失智症（MMSE：14）计算能力明显下降（20-2），失去选择适当衣服及日常活动之能力，走路缓慢、退缩、容易流泪、妄想、躁动不安1.5年5-7岁六中重度阿兹海默氏失智症（MMSE：5）无法念10-9-8-7……，需他人协助穿衣、洗澡及上厕所，大小便失禁，躁动不安，降低语言能力2.5年5-7岁七重度阿兹海默氏失智症（MMSE：0）需依赖他人持续照顾，除叫喊外无语言能力、无法行走，行为问题减少，增加褥疮、肺炎及四肢挛缩之可能性MMSE从23（轻度）→0约6年，每年约降3-4分，MMSE到0后可平均再活2-3年4周-15个月AD的临床症状及分型8第8页，课件共81页，创作于2023年2月9第9页，课件共81页，创作于2023年2月Theself-portraitofWilliamUtermohlen10第10页，课件共81页，创作于2023年2月AD的脑改变海马参与编码短期记忆，AD首先破坏了海马的神经元以及海马和大脑其他部分的连接通路。这种破坏导致了短期记忆的损伤。当大脑皮层受累后，语言能力和判断能力就被削弱，人格也发生了改变，包括情绪的爆发以及烦躁的行为。最后全脑受累萎缩。11第11页，课件共81页，创作于2023年2月AD的脑改变AD大脑体积和重量都会缩小，大脑皮质变得空虚而满是裂隙。12第12页，课件共81页，创作于2023年2月NeurofibrillaryTangleSenile

Plaque

AD特征性的病理改变

13第13页，课件共81页，创作于2023年2月(SelkoeDJ,PhysiologicalReviews2001)

AmyloidPrecursorProteinProcessingandAβgeneration

14Ab40FragmentSolubleAb42FragmentUnsoluble,aggregatesintoplaques第14页，课件共81页，创作于2023年2月

NeurofibrillaryTanglesFormation

p35p25CDK5AktGSK-3α/βCalpain15第15页，课件共81页，创作于2023年2月

NeurofibrillaryTanglesFormation

16第16页，课件共81页，创作于2023年2月A蛋白毒性学说Tau蛋白异常与神经纤维缠结基因突变学说胆碱能系统异常氧化应激炎症反应神经递质失调神经元凋亡微量元素代谢紊乱胆固醇代谢异常AD的发病机制17第17页，课件共81页，创作于2023年2月

CurrentTherapies

与神经递质有关的药物

胆碱能药物：胆碱酯酶抑制剂、M胆碱受体激动剂

非胆碱能药物：单胺氧化酶抑制剂2.NMDA受体拮抗剂：美金刚抗氧化剂：VitE、CoQ10、EGb761非甾体类抗炎药神经营养因子：NGF、BDNF雌激素脑细胞代谢增强剂脑细胞代谢激活剂：脑复康、奥拉西坦脑血循环促进剂：都可喜、喜得镇

钙离子拮抗剂：尼莫地平、氟桂嗪8.针对A的治疗BACE抑制剂、γ分泌酶抑制剂、防止Aβ形成寡聚体、增强Aβ从大脑中清除、金属离子螯合剂、调整体内胆固醇平衡、A抗体等。以tau为靶点的治疗

微管稳定剂、GSK-3抑制剂、CDK-5抑制剂、tau抗体。18第18页，课件共81页，创作于2023年2月

CurrentTherapies

药品名类型及适应症作用机理常见副作用推荐剂量美金刚Namenda®(memantine)NMDA拮抗剂，用于中到重度痴呆，可与AchE抑制剂合用保护神经细胞免遭过量兴奋性氨基酸的毒性作用头晕、头痛、便秘、意识模糊初始剂量：5mg/d,前3周应按每周递增5mg剂量的方法逐渐达到维持剂量10mg,bid加兰他敏Razadyne®(galantamine)AchE抑制剂,用于轻到中度AD可逆性AchE抑制剂，又是烟碱受体调节剂，具有双重作用恶心、心动过速、失眠、体重下降，食欲差初始剂量：4mg,bid,每四周增量8mg,达维持剂量12mg,bid艾斯能Exelon®(rivastigmine)AchE抑制剂,用于轻到中度AD乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶抑制剂，具有双重作用胃肠道症状及昏睡、疲劳初始剂量为1.5mgbid,每2周提高剂量3mg,渐达到维持量6mgbid安理申Aricept®(donepezil)AchE抑制剂,用于轻、中、重度ADAchE抑制剂恶心、呕吐、腹泻初始剂量为5mgqd,4周后加量至10mgqd维持19第19页，课件共81页，创作于2023年2月Aβ-BasedTherapeutics(BartenDM&AlbrightCF,MolNeurobiol2008)20第20页，课件共81页，创作于2023年2月Tau-BasedTherapeutics(BartenDM&AlbrightCF,MolNeurobiol2008)21第21页，课件共81页，创作于2023年2月

CurrentAlzheimer'sdiseasedrugdevelopmentprograms

22第22页，课件共81页，创作于2023年2月

CurrentTherapies

23第23页，课件共81页，创作于2023年2月

研究老年性痴呆常用的动物模型24第24页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型一、以衰老为基础的AD动物模型自然衰老认知障碍动物模型：

动物：大鼠、小鼠和猴子方法：采用6月龄Wistar大鼠，饲养12个月，成功建立自然衰老大鼠模型。特征：学习记忆和空间辨别能力缺损、神经元凋亡、胆碱能功能受损、氧化损伤、tau蛋白异常磷酸化、BACE蛋白表达增加、线粒体功能受损(18月龄自然衰老大鼠）。25第25页，课件共81页，创作于2023年2月一、以衰老为基础的AD动物模型2.快速老化小鼠(senescenceacceleratedmouse，SAM)

由日本京都大学竹田俊男教授经20年培育而成，具备均一的遗传背景和稳定老化病态特征。包括快速老化的P系(SAMP)和抗快速老化的R系(SAMR)两大系，SAMR1常被用作正常对照。特征：青年期出现脱毛、活动低下、白内障、角膜混浊、骨质疏松等老化现象，而且寿命明显缩短。中枢学习记忆功能呈增龄性加速衰退。线粒体功能紊乱和氧化应激损伤。脑内有大量Aβ沉积。

脑内与学习记忆功能相关的神经递质也发生改变。

AD动物模型SAMP1(lower)andSAMR1(upper)malesof12-month-old26第26页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型一、以衰老为基础的AD动物模型3.D-半乳糖（D-gal)诱导的亚急性衰老模型D-半乳糖衰老动物模型是由国内学者龚国清等在1991年根据衰老的代谢紊乱学说而构建的。与其他几种衰老动物模型如SAMP系小鼠衰老模型和自然衰老模型等相比，该模型简便易行，价格低廉，结果稳定，适用于抗氧化抗衰老药物研究。方法：正常大鼠或小鼠，腹腔注射或颈背部皮下注射D-半乳糖50～500mg/kg，1次/天，连续6-8周，造成衰老模型。特征：动物出现明显衰老体征，空间学习和记忆能力下降。

机体氧化自由基产物MDA与脂褐质增加，而抗氧化酶SOD活力显著降低。神经元变性凋亡增多。

视网膜色素上皮超微结构的改变。

免疫方面显示IgG水平下降，T淋巴细胞转化功能下降，血清γ干扰素下降。27第27页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型胆碱能系统的活性与人的学习记忆与认知活动过程密切相关。基底前脑胆碱能神经元、海马和皮层及它们之间的通路，是学习记忆功能的重要结构基础。AD脑组织中发现的第一个神经递质异常是乙酰胆碱（Ach），合成和降解Ach的酶活性发生变化。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前Ach的合成、ChAT的活性以及对胆碱的摄取能力都明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关。二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型28第28页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型东莨菪碱诱导的AD模型作为M型胆碱能受体的拮抗剂，东莨菪碱(Scopolamine)可以通过血脑屏障进入中枢阻断脑内的M受体，从而导致整个大脑的胆碱能神经传导障碍。方法简单、重复性好，可用于药物初筛。动物：大鼠、小鼠

方法：大鼠在实验前30min按5mg/kg体重腹腔注射东莨菪碱。

小鼠在实验前30min按1mg/kg体重腹腔注射东莨菪碱。

特征：短期的学习记忆障碍。

胆碱酯酶活性增高。SOD活力降低，MDA水平升高。29第29页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型2.鹅膏氨酸诱导的AD模型（化学损伤）谷氨酸受体激动剂鹅膏草氨酸(Ibotenicacid，IBO)是一种神经兴奋毒性剂，动物脑内注射后可致脑基底核部位神经元变性、坏死，并可导致大脑皮层和海马等部位神经元减少，引发动物行为迟钝、学习及记忆能力下降等拟似痴呆症状。

另外，海仁酸(Kainicacid，KA)、使君子酸(Quisqualicacid，QA)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)等注入动物的基底大细胞核可建立AD模型。方法：SD大鼠，雄性，体重280-300g。在立体定位仪引导下将微量注射器的针头插入颅骨下7.3mm。将1.0l的鹅膏氨酸（5g/l）在5min内缓慢注入前脑基底核，假手术组注射等体积的生理盐水，留针5min后拔出。中线对侧对称部位同法同量注射后，缝合头皮。手术后，模型组大鼠苏醒时间显著长于假手术组，造模死亡率为20%。特征：空间学习和记忆能力下降。CHAT阳性神经元数目减少。

30第30页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型3.选择性免疫毒素192-IgG-saporin诱导的AD模型（免疫损毁）

192-IgG-saporin是一种抗神经免疫毒素，一侧侧脑室注射192-IgG2-saporin后，它和细胞膜上P75受体结合进入细胞浆，192-IgG和saporin分离，saporin作用于核糖体，使核糖体大亚基失去活性，从而阻止了蛋白质的合成，导致细胞的死亡。将192-IgG-saporin注射到脑内，显示基底前脑的胆碱能神经元受到严重破坏，但该区域的其它神经元则未受损害。方法：SD大鼠，雄性，体重280-300g。在立体定位仪引导下侧脑室注射192-IgG-saporin溶液2.5μg/5μl，三周后进行行为学实验。特征：空间学习和记忆能力下降。

新皮质、海马及嗅球部位的ChAT阳性神经元数目减少，而新纹状体、中脑、脊髓等部位ChAT阳性神经元的数量没有变化。

31第31页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型电损伤、外科损毁所致AD模型

通过对动物进行手术，参照动物脑立体定位图谱，用电灼伤损毁基底前脑Meynert（NBM），外科手术切断海马穹窿伞。手术后动物出现了学习和记忆功能障碍，但病理上未出现SP和NFT，且这种方法损毁范围较大，目前已基本不采用。

32第32页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型三、以A毒性为基础的AD动物模型A注射所致的AD模型AD的基本病理改变是大脑皮层和海马区域的Aβ淀粉样斑块。Aβ由39-43个氨基酸组成，具有神经毒性作用，能引起大鼠空间学习和记忆障碍。方法：Aβ侧脑室灌注、Aβ侧脑室注射、Aβ海马注射等。特征：学习记忆障碍。皮层和海马ChAT的活性降低。损伤烟碱和KCl诱导的乙酰胆碱的释放。脑内睫状神经营养因子的水平降低。33第33页，课件共81页，创作于2023年2月34第34页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型APP转基因小鼠模型用实验的方法将外源性APP基因(野生或突变型)导入，使其在染色体基因组中稳定整合、表达，并遗传给后代。动物过多地表达APP基因或其突变基因产物，引起Aβ的沉积和相关的病理损害或临床症状。三种hAPP被应用于转基因，分别由695、751和770个氨基酸残基组成。最常使用的APP基因的突变根据它们被发现的地点命名为：Swedish(由两个相邻的突变组成：K670N&M671L)，London(V717I)和Indiana(V717F)。hAPP基因可以在不同的启动子PDGF，Thy-1或Thy-1.2(神经元特异性)和hamsterPrP(非神经元特异)的控制下，使得hAPP基因可以仅在或主要在中枢神经系统表达。（1）PDGF-APPLondon转基因小鼠：PDGF-APPLondon转基因小鼠在6~8月龄表现出胞外老年斑沉积、星形胶质细胞病变、神经元萎缩和明显的行为学异常，在斑块形成之前其CAI区树突棘密度大量减少，可以再现人类AD突触损伤进程。（2）prp-APPK670N和M671L（Tg2576）：Tg2576转基因在小鼠8~11月龄时，海马区长时程增强效应以及皮质区突触间连接均遭到破坏，从而导致记忆损伤。（3）Thy1.2-APPK670N和M671L（APP23）：APP23转基因小鼠在6月龄左右就出现淀粉样斑、淀粉样血管病和记忆缺陷，同时CAI区出现约14%的神经元丢失。（4）Thy1-APPSwDutIowa小鼠：Thy1-APPSwDutIowa小鼠在大脑表达Swedish突变K670N/M671L，荷兰突变E693Q及爱荷华突变D694N的APP770基因。3月龄时小鼠脑内就出现进行性Aβ40和Aβ42的聚集。6月龄之后弥散型类淀粉样斑块在嗅球及丘脑区大量生成，同时出现小胶质细胞和星形胶质细胞增生。35第35页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型2.PS1-AD小鼠模型

PS1L286V转基因小鼠：PS-1突变体具有增强凋亡的作用，加速了AD患者脑的退行性变性过程，PS-1突变家族性AD具有发病早的特点，而且突变型PS还抑制胆碱能神经元神经递质的合成，提示具有调节神经元表型的作用。PS1L286V转基因小鼠过表达人类家族性AD相关的PS1突变基因（L286V），可以部分再现AD的表型。36第36页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型tau-AD转基因小鼠模型（1）野生型tau转基因鼠：表达人类最短tau蛋白基因转录的转基因鼠表现出进行性的中枢神经系统病理改变，包括高度磷酸化的不溶性tau蛋白，皮质、脑干和脊髓区出现含tau蛋白阳性细丝、嗜银神经元内包涵体，星形胶质细胞增生，快速轴突运动受损，以及伴随轴突变性出现的渐进性运动能力减弱等。（2）TauP301L突变转基因鼠：表达P301L突变的tau蛋白转基因鼠在4、5月龄出现运动和行为缺陷，在杏仁核、隔核、视前核、下丘脑、中脑、脑桥、延髓、小脑深部核团和脊髓出现神经原纤维缠结及类似于Pick体的神经病变，在皮质、海马和基底神经节出现缠结前病变。脊髓前角运动神经元数目减少约48%。（3）tauV377M突变转基因鼠：tauV377M突变转基因鼠神经元体积变小和表面向外突起等形态改变。海马神经元活力降低，行为学异常。表现出与人类AD类似的神经病理和行为特征。37第37页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型38第38页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型4.APP/PS-AD双转基因小鼠模型通过重组DNA技术将两种外源性突变基因同时转染小鼠，这两种突变基因将整合人小鼠的基因组中，所得到的小鼠称作双转基因小鼠。双转基因小鼠与单APP转基因小鼠相比，加快了淀粉样沉积的速度，最早形成老年斑的年龄显著降低。（1）APPSWE×PS1M146L双转基因小鼠：3个月时，突触可塑性的损害开始出现；6个月出现淀粉样斑块；8个月时出现选择性空间记忆损害。22个月时，Aβ负荷大量增加。（2）APPSWE×PS1L166P双转基因小鼠：3个月时见肿胀的球茎状异常轴突；脑淀粉样变于6-8周在海马开始出现，小胶质细胞的数量在1-8月增加了3倍，神经元丢失很少。Aβ42比Aβ40多几倍。8个月时神经发生(neurogenesis)减少。（3）APPSL×PS1M146L双转基因小鼠：在两个月可见细胞内Aβ堆积；3个月在皮质和海马产生细胞内Aβ和细胞外Aβ聚集；17个月时发现大量海马锥体细胞丢失；出现与年龄相关的脑萎缩，包括中脑和内囊，肼胝体和穹窿。（4）APPSL×PS1ki双转基因小鼠：病变严重且发展迅速，细胞外Aβ迅速沉积，在海马CA1区出现年龄依赖性的大量神经元丢失。10个月大时无论雄鼠还是雌鼠在CA1/2亚区都有广泛的神经元丢失，Aβ42是此模型产生的主要Aβ。（5）APPSWE×PS1dE9双转基因小鼠：2-3个月皮质和海马发生胆碱能轴突肿胀，呈ChAT和AchE阳性反应；6个月开始在大脑皮质、海马和杏仁体形成大量淀粉样斑块；15个月时，在杏仁体和海马出现大量活化的星形胶质细胞；18个月时海马5-HT和NE水平下降。39第39页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型APPSWE×PS1M146L×TauP301L-AD三转基因小鼠模型神经细胞内Aβ免疫反应性。细胞外出现Aβ沉积，主要集中在额叶皮层，到15月龄则在枕叶与顶叶出现了Aβ

沉积，这说明了3×Tg-AD小鼠Aβ沉积具有年龄相关性和区域依赖性。12月龄有明显的tau蛋白异常磷酸化。活化星型胶质细胞聚集在胞外Aβ沉积物周围。海马CA1区锥体神经元内Aβ免疫反应性与突触可塑性的损伤有关联，

包括LTP。突触传递与LTP障碍早于

沉积物与NFT形成，提示突触

功能障碍是AD早期表现。40第40页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型6.APP/PS五转基因小鼠模型APP/PS1双转基因小鼠同时表达5种FAD突变APPK670N/M671L(Swedish)APPI716V(Florida)APPV7171(London)PS1M146LPS1L286V此型表现出Aβ42非常快速的沉积。在1.5个月可见细胞内Aβ42聚集，2个月开始出现淀粉样沉积，大约4个月出现记忆损害，9个月时在大脑皮层(第V层)出现大量的大锥体神经元丢失，与淀粉样蛋白沉积出现的区域相同。41第41页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型四、转基因AD动物模型ApoE基因敲除和转基因小鼠模型

ApoE作为一种与血脂转运有关的血浆蛋白，在外周和中枢神经损伤的再生中起部分作用，可将脂类转送到细胞内，参与神经元轴突的伸展和生长。ApoE对调控大脑中Aβ的含量、沉积和分解起着至关重要的作用。ApoE敲除小鼠：表现出异常高血脂症状，在3月龄时即出现动脉脂肪堆积。随着月龄增加出现大量类似动脉粥样硬化前期损伤。17月龄时小鼠脑内出现脂瘤性纤维瘤，同时还有脂质小球和泡沫细胞。基因敲除小鼠表现为突出损伤和学习记忆能力障碍。ApoE4转基因鼠模型：学习记忆缺失，子代小鼠中存在大量SPs，胆碱乙酰转移酶活性明显降低。42第42页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型五、三氯化铝致鼠痴呆模型铝可进入脑内取代钙和镁离子，同氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸的羧基结合形成谷氨铝盐或精氨酸铝盐的稳定复合物而沉积于脑内，引起双螺旋纤维蛋白异常磷酸化反应，形成神经元缠结，引起Aβ的形成而产生老年斑，最终导致神经元死亡。方法：1.小鼠腹腔注射法：小鼠，体重(30±4)g，12月龄，雄性。用AlCl3溶液100mg/kg腹腔注射，隔日一次，连续50d。2.小鼠灌胃给药法：小鼠，体重(30±4)g，12月龄，雄性。每日上午以AlCl3溶液200mg/kg剂量灌胃给药，共90d。3.大鼠颈背部皮下注射法：SD大鼠，体重(300-350)g，雄性。在大鼠颈背部皮下注射pH值为6.5的1.5%的AlCl3溶液60mL/kg，每日1次，连续20d。4.大鼠灌胃给药法：Wistar大鼠，体重(200-220)g，雄性。按每天灌服AlCl3溶液500mg/kg，共30d。特征：空间学习和记忆能力下降。海马及脑皮层M受体亚型的含量减少。小鼠部分脑区中的铁及铁蛋白的分布异常。

SOD、GSH-PX活性减少、MDA含量升高海马内APP阳性神经元的数量增多。神经元凋亡率。43第43页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型六、冈田酸(okadaicacid，OA)慢性损害模型OA是一种磷酸酯酶抑制剂，能抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A的活性。正常胞内磷酸酯酶和磷酸激酶处在动态平衡之中，OA通过抑制磷酸酯酶的活性，使激酶处于相对高的活性状态，从而能使tau蛋白高度磷酸化并形成NFT样改变。方法：通过微渗透泵输送OA到侧脑室或海马注射。特征：大鼠脑的纹状体、海马和皮质等部位出现高度磷酸化Tau蛋白免疫阳性神经元、APP免疫阳性星形胶质细胞和Aβ免疫阳性斑块，并伴有记忆损害。44第44页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型七、Wortmannin和GF-109203X联用损害模型大鼠侧脑室或双侧海马注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)和GF-109203X(蛋白激酶C抑制剂)。特征：1.大鼠出现明显行为学障碍。

2.模型组大鼠海马GSK-3酶活性增加到原来的3.7倍。

3.模型组大鼠Tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/404位点磷酸化明显增强，并出现NFT样病理变化；而骨架蛋白Tau的这些特殊位点的磷酸化程度与动物的学习、记忆障碍正相关，即Tau蛋白过度磷酸化程度越高，大鼠学习记忆能力越差。该类模型可用于筛选针对蛋白激酶过度激活引发的Tau蛋白AD样异常过度磷酸化、NFT样病理变化及学习、记忆障碍的AD治疗药物，还可用于研究蛋白激酶和AD发病机制之间的内在关系。45第45页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型八、老年动物慢性脑缺血痴呆模型人脑的供氧系统对脑功能有重要的保护作用。缺氧缺血首先影响的是正常脑功能。此时极易出现智能障碍。通常老年动物脑血流较成年动物减少20%以上。

慢性缺血痴呆模型是通过结扎老年大鼠的双侧颈总动脉和一侧椎动脉或者一侧锁骨下动脉，造成老年脑的长期供血不足和相应的脑损害，这些脑损害与AD的临床表现和病理改变有一定相似性。特征：1.水迷宫测试显示空间记忆能力明显下降。2.神经元丢失。3.胶质纤维酸性蛋白免疫反应增强。

该模型可用开发记忆障碍药物的临床前筛选，但该模型出现的神经病理学改变广泛，适用于研究混合型老年性痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究。46第46页，课件共81页，创作于2023年2月

AD动物模型九、复合型AD动物模型Aβ与D-gal联合诱导的AD模型。IBO与D-gal联合诱导的AD模型。喹啉酸(QA)与D-gal联合诱导的AD模型。QA是兴奋性氨基酸受体激动剂，QA海马内注射可破坏海马胆碱能神经元。氯化铝(AlCl3)与D-gal联合诱导的AD模型。亚硝酸钠(NaNO2)与D-gal联合诱导的AD模型。

由于NaNO2

会将正常血红蛋白变为高铁血红蛋白而失去携氧能力，造成全身反复慢性缺氧，特别对脑的代谢有较大影响。东莨菪碱(SCOP)、AlCl3与D-gal联合诱导的AD模型。IBO、Aβ1-40与D-gal联合诱导的AD模型。IBO、醋酸氢化可的松龙与D-gal联合诱导的AD模型。47第47页，课件共81页，创作于2023年2月

研究抗老年性痴呆药物的主要方法行为学测定Ab途径的测定Tau蛋白途径的测定氧化损伤的检测神经炎症反应的检测神经退行性改变测定神经发生的检测神经递质的改变的测定48第48页，课件共81页，创作于2023年2月Morris水迷宫（Morriswatermaze，MWM）MWM实验是一种强迫实验动物（大鼠、小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马／外海马研究、智力与衰老、新药开发／筛选／评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域，在世界上已经得到广泛地认可，是学习与记忆研究的首选经典实验。实验原理：

虽然老鼠是天生的游泳健将，但是它们却厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，他们会本能的寻找水中的休息场所。寻找休息场所的行为涉及到一个复杂的记忆过程，包括收集与空间定位有关的视觉信息，再对这些信息进行处理、整理、记忆、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隐藏在水中的站台，最终从水中逃脱。

行为学实验49第49页，课件共81页，创作于2023年2月50第50页，课件共81页，创作于2023年2月51第51页，课件共81页，创作于2023年2月2.八臂辐射状迷宫（RadialArmMaze）实验原理：利用食物作为激励措施使饥饿的动物到达目的地。小鼠若想利用最短的时间或最小的错误来寻求奖赏，它必须利用空间线索来实行特别的搜索策略。在实验中，动物需要记住那些臂已被探索过，食物已被摄取，以免再次进入，从而在最短的时间内获得最多的食物。动物适应实验环境1周后，称重，禁食24小时。此后每天训练结束后限制性地给予正常食料（据体重不同，大鼠16-20g，小鼠2-3g），以使体重保持在正常进食大鼠的80%-85%。

行为学实验52第52页，课件共81页，创作于2023年2月3.T迷宫（Tmaze）实验原理：利用食物作为激励措施使饥饿的动物到达目的地。Ｔ迷宫是检测啮齿类动物空间工作记忆的一种经典行为学方法，与前额叶皮层功能相关。小鼠节食至原体重85％。实验设备：迷宫由两个目标臂（goalarms）和一个与之垂直的主干臂（stem）或起始臂（approachalley）组成。饮水不限，但进食控制在每天16-20g，以使体重保持在非进食大鼠体重的85%。在整个训练和测试期间，大鼠体重每周增加不超过5g。实验方法1.训练前2d，小鼠放入T迷宫适应10min，在迷宫两臂碗里放入食物，待小鼠取食完毕后将其取出。2.训练实验：每一个trial包括两个部分，即forcedrun和testrun。forcedrun：任意选择T迷宫的一臂，用木闸门将之关闭，小鼠只能进入一臂获取食物。取食完毕，立即取出，用酒精清洗去除气味。15s后，撤去所有的闸门。Testrun：两臂全部打开，将小鼠放入开始臂中，若小鼠选择未曾进入的臂，为正确选择，给予食物奖励；若重复进入相同的臂，则为错误选择，不给予食物。每只动物每天进行4个trial，每次间隔15min，连续4d，分别计算每天每组小鼠的正确率。当平均正确率都达到85％以上，训练阶段结束。3.测试实验：延长forcedrun和testrun之间的时间间隔至1min和3min，分别计算每组小鼠的正确率。

行为学实验53第53页，课件共81页，创作于2023年2月4.Y迷宫（Ymaze）Y迷宫能够检测啮齿类动物与海马和前额叶脑区相关的空间记忆。实验装置：

环境为安静暗室。Y-迷宫为一个三等臂式反射箱，三臂的夹角为120°，底部为可通电的铜棒，每臂端有一信号灯，灯亮表示安全区，此臂不通电无电流，另两臂通电(电压50

~

70

V，大致固定在能使小鼠产生逃避行为的强度)。实验开始时，让大鼠在起步区(大鼠开始所在的臂)适应5min，然后无规则次序变换安全区，观察动物学会逃离电击区而进人安全区的反应能力。规定大鼠在受电击后10s内一次性跑向安全区为正确反应。实验中每次通电刺激的间隔时间为30s。以大鼠连续训练10次中出现9次以上正确反应作为学会的标准，以达到学会标准所需总电击次数表示学习成绩。2

4

h

后进行记忆保持能力的检测，以正确反应次数占总检测次数的百分比表示记忆保持能力(正确反应的次数/总检测次数×100%)，此值越高说明记忆力越好。

行为学实验54第54页，课件共81页，创作于2023年2月5.避暗实验（passiveavoidance）

实验原理：避暗又称为被动回避利用小鼠或大鼠具有趋暗避明的习性设计的装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅。动物进入暗室即受到电击。本实验简单易行，反应箱越多，同时训练的动物越多。以潜伏期为指标，动物的差异性比较小。对记忆过程特别是记忆再现有较高的敏感度。实验方法：（1）将小鼠放入明箱，10s后，将明暗箱之间的门打开。多数品系的小鼠有很强的探究行为，喜暗恶光。因此，小鼠会很快进入暗箱。（2）小鼠（四肢）完全进入暗箱后，立即将中门关上，并给予一次电击。电击强度为能引起小鼠退缩和发声的最小电流。根据小鼠品系不同，电流范围为0.2~0.8mA(100V，50~60HzAC)，持续1~2s。（3）让小鼠在暗箱内停留10s（以使让动物形成箱与电击之间的关联），将小鼠放回笼内。清洁操作箱。进行下一只动物的训练。

（4）记忆保持测试

电刺激训练24h后，将小鼠放回明箱，中门打开，但不给电击，。

观察指标：潜伏期、错误次数

行为学实验55第55页，课件共81页，创作于2023年2月

行为学实验5.避暗实验56第56页，课件共81页，创作于2023年2月6.跳台实验实验原理：跳台实验属一次性刺激回避反应实验。跳台法的实验装置一般为一长方形反射箱，其长径被黑色塑料板隔为若干区间，底部铺以间距为5mm的铜栅，可通适当的电流。每个小的区间有一个高和直径均为4.5cm的小平台。实验方法：实验时，首先将小鼠放在铜栅上，当铜栅通电时，跳在铜栅上的小鼠受到电击，其正常反应是躲避电击跳上平台，大多鼠有可能再次或多次跳下平台受到电击，受到电击时又会迅速跳回平台。如此训练5min，并记录每只鼠受到电击的次数（错误次数），以此为学习成绩。24h后重新测验，此次测验时，首先将鼠放在跳台上，记录第一次跳下的时间（潜伏期）、受电击的动物数和3min内的错误次数，以此反映记忆保持情况。测定指标：潜伏期、错误次数

行为学实验57第57页，课件共81页，创作于2023年2月7.条件性恐惧实验（ContextualFearConditioning）实验原理：动物遭受痛苦刺激如电击后，可记住受苦时的环境和场景如伴随的声、光等。当再次遭遇原环境或场景后就会表现出恐惧反应。啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动状态（Freezing），动物在这种情况下倾向于保持静止不动的防御姿势。实验方法：实验对象被给与一个声音信号（条件刺激），随后给予电击（非条件）刺激。该训练称为条件性训练，训练结束后实验动物进行声音信号或环境联系性实验。一般情况下啮齿类动物对相应的环境和不同环境下同样的声音信号都会做出明显的条件性恐惧反应，如静止不动。这种测试可以在训练结束后立刻或几天后进行可以提供在条件信号影响下短期和长期记忆的信息。测定指标：动物静止不动的时间(freezingtime)，并计算静止不动的时间占总时间的百分比(percentoffreezingtime)

行为学实验58第58页，课件共81页，创作于2023年2月8.物体识别实验（objectrecognitiontest）原理：小鼠有探索新物体的习性。当能区分出熟悉的物体和新物体时，它总是要花较长的时间探索新物体。该实验可测定视觉认知记忆，是海马依赖性认知实验。

行为学实验5924h实验准备及认知训练：1.实验装置为一正方形白色塑胶材料制作的畅箱。2.实验动物在训练前必须在前一日适应环境5min。3.两相同物体为正方形蓝色积木。4.实验时放置动物到两物体正中间位置，计时5min。5.记录动物对两物体的探索时间。认知测试：1.其中一物体更换为新物体。2.记录5min内动物对新旧物体的认知时间。Therecognitionindex（认知指数）:Tn/(Tn+Tf).Tn=对新物体认知时间；Tf=对旧物体认知时间探索：指小鼠鼻子在2cm内指向物体或鼻子触及物体。59第59页，课件共81页，创作于2023年2月9.其他实验：Barnes（巴恩斯）型迷宫6或8臂辐射状水迷宫实验LashleyIII水迷宫H-W水迷宫嗅觉辨别

行为学实验60第60页，课件共81页，创作于2023年2月

APP及Ab相关的检测指标Ab的生化测定：样品：血浆、脑组织（皮层、海马、小脑）方法：ELISA

61第61页，课件共81页，创作于2023年2月

APP及Ab相关的检测指标Ab的特殊染色：HE、ThioflavinS、Bielschowskysilverstain、Congored

Amyloidinfiltratesthewallofthissmallvessel(H&E).Typicalplaquewithamyloidcoreanddystrophicneurites（Thioflavinstain）

SilverstainCongoredstainluminescentconjugatedpolymer(LCP)PTAA62第62页，课件共81页，创作于2023年2月

APP及Ab相关的检测指标3.Ab的免疫组化染色常用的抗体：6E10、4G8、Anti-Abeta1-40/42等公司：Covance、ELANpharmaceuticals、EMDMillipore、LifeTechnologiesCorporation、Karen等。

63第63页，课件共81页，创作于2023年2月

APP及Ab相关的检测指标APP加工过程及信号调节通路

方法：Westernblot或直接测定酶活性指标：APP、αAPPs、CTFs、ADAM10、ADAM17、BACE、IDE、NEP、PKC、MAPKMAPK64第64页，课件共81页，创作于2023年2月

tau磷酸化及NFT检测1.NFT特殊染色Silverstain、ThioflavinSTanglesasdrawnbyBonfiglioin1908withsilverstain.TanglesasseenwithThioflavinS.65第65页，课件共81页，创作于2023年2月

tau磷酸化及NFT检测2.Tau和NFT的蛋白表达方法：WesternblotTau5-totaltau;CP27-totalhumantauAT180,CP9,andCP17-pThr231-tau;AT8-pSer202/pThr205-tauAT100-pThr212-tauintheNFT-specificconformationMC1-tauintheearlyNFTconformationPHF-1-tauinthelateNFTconformationpolyclonalP-tau(ser199)antibody;polyclonalP-tau(Thr205)antibodypolyclonalP-tau(ser396)antibody;polyclonalP-tau(ser404)antibody66第66页，课件共81页，创作于2023年2月

tau磷酸化及NFT检测3.Tau和NFT的染色方法：IHC，IFFluorescentdoublelabelingof3xTg-ADmice.IntraneuronalAβ(green)colocalizeswithΔTau(red)withinCA1pyramidalneuronsof12-month-old(A)and18-month-old(B)3xTg-ADmiceandwithin18-month-oldneocortex(C).ΔTauimmunoreactivity(red)alsocolocalizeswithanearlytanglemarker,MC1(green),withinCA1pyramidalneuronsatboth12-month(D)and18-monthtimepoints(EandF).Phospho-tauimmunoreactivityfromtheCA1hippocampalsectorof18-month-oldtransgenicmice.ImmunohistochemistryperformedwithT-14(A–C),12E8(D–F),AT-180(G),AT-8(H)andPHF-1(I).67第67页，课件共81页，创作于2023年2月

tau磷酸化及NFT检测4.Tau蛋白磷酸化激酶的检测方法：Westernblot和酶活性测定ImmunofluorescencestainingofGSK-3β(Ser9)(green)68第68页，课件共81页，创作于2023年2月

氧化损伤的检测检测指标：活性氧自由基（ROS）、超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、总-SOD）、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）、过氧化物酶(POD)、一氧化氮合成酶（NOS）、丙二醛（MDA）、

4-羟基壬烯醛（HNE）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧阴离子自由基、一氧化氮（NO）方法：生化测定公司：南京建成生物工程研究所69第69页，课件共81页，创作于2023年2月

神经炎症反应的检测70第70页，课件共81页，创作于2023年2月

神经炎症反应的检测小胶质细胞活化

方法：IHC、IF、Westernblot常用抗体：CD45、CD11b、CD40、Iba-1、F4/80、CD68、MHC-II、ED1、Mac-1等。Microglia(Iba-1,brown)accumulatearoundAβplaques(Congored,red)intransgenicmousemodelsofAD.

Double-labelingimmunofluorescenceanalysesofAβdepositandmi