微生物技术要素宣贯昆明

微生物技术要素宣贯昆明第1页，课件共80页，创作于2023年2月微生物专业认可特色

(与其他检验专业的区别)定性试验多，统一标准难晚于其他专业认可，评审专家角色重要、甚至出现争议（CNAS率先）对策：专家团队专业知识全面、制定统一标准

出现的问题种类繁多从项目申报的问题到指导临床，遍及全过程对策：系统学习认可知识，参加培训宣贯专业知识独特，进展多，变化快新老知识交叉出现对策：对于评审专家来讲—-学习对于被评审单位—-我今讲最新CLSI进展第2页，课件共80页，创作于2023年2月主要讲课内容新版

“应用说明”技术要素内容及理解：（医学实验室质量和能力认可准则临床微生物学检验领域的应用说明）CLSIM100-S22，即2012版生物安全内容在ISO15189中的体现第3页，课件共80页，创作于2023年2月医学实验室质量和能力认可准则临床微生物学检验领域的应用说明CNAS-GLxx：2012医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南CNAS-GL23：2008

第4页，课件共80页，创作于2023年2月认可申请中常见问题—申报项目培养和鉴定（普通细菌6B010）：上呼吸道标本：与A组链球菌(分析物编码即领域代码前四位:6B070)、流感嗜血杆菌组合认可。下呼吸道标本:与肺炎链球菌(6B075)、流感嗜血杆菌组合认可。粪便：与沙门菌鉴定(6B085)+血清学分类(6B820)、志贺菌鉴定+血清学分类、霍乱弧菌鉴定+血清学分类组合认可脑脊液：与肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌组合认可药物敏感性试验（普通细菌6C010）：自动化仪器检测法应与纸片扩散法和/或药敏试验（最低抑菌浓度）组合认可纸片扩散法应与药敏试验（最低抑菌浓度）组合认可第5页，课件共80页，创作于2023年2月解读“应用说明”

4管理要求4.1组织和管理4.1.1实验室为独立法人单位的，应有医疗机构执业许可；

实验室为非独立法人单位的，其所属医疗机构执业证书的诊疗科目中应有医学实验室，自获准执业之日起，开展医学检验工作至少2年。new!第6页，课件共80页，创作于2023年2月

解读“应用说明”

5技术要求5.1人员5.1.2微生物实验室（以下简称“实验室”）工作人员上岗前应接受辨色力检查。5.1人员5.1.2微生物实验室的工作人员在上岗前需接受辨色力检查。需具备相关教育背景，并至少每年接受微生物专业技术及知识培训，熟悉微生物学实验室操作规程、消毒灭菌及生物安全知识。人员数量需满足所提供的服务的要求。

(已删除）第7页，课件共80页，创作于2023年2月5.1.4实验室负责人至少应具有以下资格：中级技术职称，医学、医学检验专业背景，或相关专业背景经过医学检验培训，3年临床微生物工作经验。5.1.3实验室负责人至少具有以下资格：a)医学实验室工作经历或培训2年以上；或b)医学实验室相关专业高级技术职称；或c)检验、生物化学、化学、生物科学等主修专业博士，医学实验室工作经历或培训2年以上；或d)检验、生物化学、化学、生物科学等主修专业硕士，医学实验室工作经历或培训4年以上；或检验、生物化学、化学、生物科学等主修专业学士，医学实验室工作经历或培训8年以上。new!第8页，课件共80页，创作于2023年2月认可的授权签字人应至少具有中级以上专业技术职称，从事申请认可授权签字领域专业技术工作至少3年。当微生物实验室作为医学实验室的一部分申请认可时，其负责人需有大学本科以上学历或中级以上技术职称，五年以上本专业工作经历。new!第9页，课件共80页，创作于2023年2月5.1.6应每年对各级工作人员制定培训计划并进行微生物专业技术及知识培训、质量保证/质量管理培训、客户服务培训、安全培训、继续教育培训。5.1.6实验室需每年对各级工作人员制定培训计划并进行质量保证/质量管理训、客户服务培训、安全培训、继续教育培训。至少每6个月对人员进行胜任该岗位的考核，没有通过岗位职责考核人员需再培训和再考核，并记录。

（已删除）第10页，课件共80页，创作于2023年2月5.2设施和环境条件5.2.1实验室应有足够的办公、文字处理、培养基制备、实验工作空间。宜有适当的水池、排水管道、电源插座、通风设施、通讯设备。5.2.1.1微生物实验室建筑、设施需与实验室从事的相应生物安全等级相符合。第11页，课件共80页，创作于2023年2月(此页为新增内容）5.2.2应定期根据工作流程及性质实施安全风险评估，根据生物安全理论和技术的新进展制定、修订相应的生物安全操作和防护规程并进行培训，以减小职业暴露的危险。当工作流程及性质发生变动时，应及时实施再评估。new!第12页，课件共80页，创作于2023年2月评估考虑内容：微生物危险度≠风险评估

风险评估：

微生物危险度×合理的预防措施恒定不变×

0≈0

第13页，课件共80页，创作于2023年2月续5.2.2至少应规定如下安全要求：(a)不同控制区域的防护措施及合适的警告；(b)已知或有潜在经空气、气溶胶传播危险的标本或病原体在生物安全柜内操作；(c)标本安全运送及处理，如工作人员接种疫苗，戴手套和进行呼吸道防护（适用时），确保容器密封性，嗅平板时的潜在危害及其防护等；(d)渗漏标本的处理措施；(e)工作环境及设备的消毒措施new!第14页，课件共80页，创作于2023年2月5.2.4实验室内照明宜充足，避免阳光直射及反射，如果可能，可在实验室内不同区域设置照明控制，以满足不同实验的需要。应有可靠的电力供应和应急照明。5.2.4实验室内照明宜充足，避免阳光直射及反射，如果可能，可在实验室内不同区域设置照明控制，以满足不同实验的需要。宜有可靠的（不一定需要不间断电源或双路供电）电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等宜设专用电源。宜有适当的气体供应，以满足工作类型及工作量的需要。第15页，课件共80页，创作于2023年2月5.2.10应制定生物安全事故和危险品、危险设施等意外事故的预防措施和应急预案，并对全体人员进行培训。（新增内容）(生物安全认可ISO15489，实验室安全认可15490)new!第16页，课件共80页，创作于2023年2月5.3实验室设备5.3.1设备配置应与实验室服务相适应，生物安全柜的类型和安装应满足工作要求；孵育箱的数量和种类应满足诊断需要（如特殊温度范围和气体要求）；应贮存与诊断相配套的质控物，以便在染色、试剂、试验、鉴定系统和敏感性试验中使用；无菌体液的显微镜检查应配备细胞离心机。5.3.1设备配置需与实验室服务相适应，如：有一定数量和类型的孵育箱，以满足诊断需要（如特殊温度范围）；贮存与诊断相配套的质控物，以便在染色、试剂、试验、鉴定系统和敏感性试验中使用；脑脊液检查配备细胞离心机。new!第17页，课件共80页，创作于2023年2月DiagramCleanbenchClassIBSCClassIIBSCClassIIIBSC生物安全柜与洁净台：风向+与外界相连

BSL-3百万级Lab分子生物学Lab

3.生物安全柜与洁净台的区别第18页，课件共80页，创作于2023年2月实验室结构（负压）与生物安全柜？第19页，课件共80页，创作于2023年2月5.3.2设备校准、维护及性能等应符合如下要求：（a）自动化鉴定仪、血培养仪的校准应满足制造商建议；（b)每半年进行检定或校准的设备至少应包括浊度仪；(c)每年进行检定或校准的设备至少应包括：生物安全柜（高效过滤器、气流、负压等参数）、CO2浓度检测仪、细胞离心机、压力灭菌器、游标卡尺、培养箱、温度计、移液器、微量滴定管或自动分配器。(d)应保存仪器功能监测记录的设备至少应包括：温度依赖设施（冰箱、孵育箱、水浴箱、加热块等每日记录温度）、CO2培养箱（每日记录CO2浓度）、超净工作台（定期做无菌试验）、压力灭菌器（至少每个灭菌包外贴化学指示胶带、内置化学指示卡，定期进行生物监测）；(e)应制定预防性维护计划并记录的设备至少应包括：生物安全柜；CO2培养箱、自动化鉴定仪、血培养仪、压力灭菌器、超净工作台、显微镜和离心机。new!第20页，课件共80页，创作于2023年2月(此页为新增内容)5.3.4所有试剂应标注或能追溯的信息包括：名称、浓度或滴度，存放条件，失效期。若试剂启封，改变了有效期和储存条件，宜记录新的有效期。试剂的储存条件应遵循生产商的建议，并在标明的有效期内使用。培养基标签应包含生产日期（批号）、保质期（或失效期），适用时包括配方、质量控制、贮存条件等信息。药敏用标准菌株种类和数量应满足实验室工作要求，并保存其来源、传代等记录，并有证据表明标准菌株性能满足要求。5.3.7如果设备故障影响了方法学性能，在设备修复、校准后，实验室应对设备性能进行验证，例如检测质控菌株或已知结果的标本。new!第21页，课件共80页，创作于2023年2月5.4检验前程序5.4.1检验申请单应包括标本来源和临床诊断，必要时说明感染类型和/或目标微生物，宜提供抗菌药物使用信息。5.4.1检验申请单需包括标本来源，必要时说明感染类型和/或目标微生物。new!第22页，课件共80页，创作于2023年2月5.4.3除通用要求外，微生物标本的采集及运送指南，还应包括以下内容：不同部位标本的采集方法。如：明确说明并执行血培养标本采集的消毒技术、合适的标本量。诊断成人不明原因发热、血流细菌感染时宜在不同部位抽血2套，每套2瓶（需氧、厌氧各一瓶）。合格的标本类型、送检次数、标本量。如：痰标本直接显微镜检查找结核杆菌或结核杆菌培养，应送检三份痰标本。最好至少连续3日，采集每日清晨第一口痰。明确规定需要尽快运送的标本；5.4.3除一般要求外，微生物标本的采集及运送指南，需特别注意以下内容：a)不同部位标本的采集方法。如：明确说明并执行血培养标本采集的消毒技术、合适的标本量；b)合格的标本类型、送检次数、标本量。如：粪便常规培养在未向专业人员咨询前，每位患者采集标本不多于2份；c)需明确规定需要尽快运送的标本，以最大程度地减少延误并尽快处理；new!第23页，课件共80页，创作于2023年2月5.5检验程序

5.5.1细菌培养和鉴定程序应满足如下要求：所选择的涂片、染色技术、培养基应能从标本中分离、识别相应的病原菌；鉴定方法应符合要求（如：通过血清学、革兰染色、菌落形态、生长条件、代谢反应、生化和酶活性、抗菌药物耐药性谱等特性鉴定）；应有处理组织标本的能力。应明确伤口标本培养程序，深部伤口感染应至少包括标本采集、需氧菌及厌氧菌的培养及鉴定。如果不具备厌氧培养条件，则应有程序表明，标本置合格的运送系统迅速送有条件的实验室。应有适当的方法检测苛养菌（如放线菌，快速生长的分枝杆菌等）。(少了一句：最好进行直接涂片革兰染色检查并报告结果。）厌氧菌培养时间与标本类型、诊断有关，在第一次培养评估之前应有足够的培养时间（至少48小时）。应有合适的液体培养基，有合适的鉴定方法（适用时）。第24页，课件共80页，创作于2023年2月细菌抗菌药物敏感性试验程序应满足如下要求：(a)应制定常规药敏试验方法（纸片扩散法、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法、E试验或其他）的操作程序（含各类病原体和/或标本的检测药物、质控标准、结果解释等）；(b)抗菌药物敏感性试验方法包括纸片扩散法、稀释法（琼脂稀释法、肉汤稀释法）、浓度梯度扩散法（E试验）或自动化仪器检测；实验室应提供与服务相适应的抗菌药物敏感性试验；(c)抗菌药物敏感性试验方法及结果判断至少应遵循上一年的标准。抗菌药物敏感性试验方法包括纸片扩散法、稀释法（琼脂稀释法、肉汤稀释法）、浓度梯度扩散法（E试验）或自动化仪器检测。实验室需遵循一定的准则，提供与服务相适应的抗菌药物敏感性试验，并能检测苯唑西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌、碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌等。new!第25页，课件共80页，创作于2023年2月2012年新增指标新增指标名称要求8急诊患者抗菌药物处方比例＜40%9住院患者特殊使用抗菌药物使用率10限制使用抗菌药物治疗住院患者微生物样本送检率＞50%11特殊使用抗菌药物治疗住院患者微生物样本送检率＞80%12特殊使用抗菌药物使用强度第26页，课件共80页，创作于2023年2月2012年卫生部明确要求7种I类切口手术：①腹股沟疝修补术（包括补片修补术）②

甲状腺疾病手术③

乳腺疾病手术④

关节镜检查手术

⑤

颈动脉内膜剥脱术

⑥

颅骨肿物切除术⑦

经血管途径介入诊断手术

原则不使用抗菌药物！第27页，课件共80页，创作于2023年2月2011年上级要求：7项指标指标名称要求1住院患者抗菌药物使用率＜60%2门诊患者抗菌药物处方比例＜20%3I类切口手术患者预防使用抗菌药物比例＜30%4预防用抗菌药物术前0.5-2h内给药百分率100%5I类切口预防用抗菌药物时间≤24h的比例100%6抗菌药物患者微生物检验样本送检率＞30%7抗菌药物使用强度（DDD）＜40第28页，课件共80页，创作于2023年2月重症医学科41株金葡药敏情况（92.7％MRSA）第29页，课件共80页，创作于2023年2月急诊病房+急诊ICU40株金葡药敏情况(100%MRSA)第30页，课件共80页，创作于2023年2月儿科病房50株金葡药敏情况（8%MRSA）第31页，课件共80页，创作于2023年2月医院前10位：口服剂型（按频度）2012.42012.32012.2莫西沙星（拜复乐）莫西沙星（拜复乐）莫西沙星（拜复乐）头孢唑肟头孢唑肟头孢唑肟依替米星（创成）依替米星（创成）左氧氟沙星（利复星）左氧氟沙星（利复星）左氧氟沙星（利复星）依替米星（创成）阿莫西林/克拉维酸头孢他啶（复达欣）头孢哌酮/舒巴坦头孢哌酮/舒巴坦阿莫西林/克拉维酸阿莫西林/克拉维酸乳糖酸阿奇霉素乳糖酸阿奇霉素磷霉素左氧氟沙星（可乐必妥）左氧氟沙星（可乐必妥）左氧氟沙星（可乐必妥）氨曲南头孢哌酮/舒巴坦乳糖酸阿奇霉素头孢呋辛钠750mg磷霉素氨曲南第32页，课件共80页，创作于2023年2月33

CLSI2012年药敏试验标准的更新点

第33页，课件共80页，创作于2023年2月34

CLSI药敏标准–

2012年1月M100-S22表格(2012)*M02-A11纸片扩散法(2012)^M07-A9MIC法(2012)^*M100每年更新一次#M02,M07每三年更新一次第34页，课件共80页，创作于2023年2月

M1002012改变肠杆菌科菌铜绿假单胞菌葡萄球菌属35第35页，课件共80页，创作于2023年2月肠杆菌科菌-20121.澄清了何时进行ESBL检测-简短地2.澄清了何时进行MHT试验3.重新修订了厄他培南折点--针对2011年公布折点进行修订4.增加了环丙沙星对于伤寒沙门菌和肠道外沙门菌的折点36第36页，课件共80页，创作于2023年2月MHT:碳青霉烯酶分类类碳青霉烯酶发现于注释AKPC肠杆菌科菌水解所有beta内酰胺类。被克拉维酸抑制。SME粘质沙雷菌B金属酶(IMP,VIM,GIM,SPM,NDM)铜绿假单胞菌肠杆菌科菌

不动杆菌嗜麦芽窄食单胞菌水解除氨曲南的所有beta内酰胺类。被克拉维酸轻度抑制。发挥酶活性需要锌离子;被EDTA抑制.37Reference:Queenan&Bush.2007.ClinMicrobiolRev.20:4402.澄清了何时进行MHT第37页，课件共80页，创作于2023年2月38

如果实验室没有使用最新的碳青霉烯折点，仍然需要进行MHT试验….

如果实验室已经使用最新的折点，那MHT只需要根据流行病学或感控目的进行。并不是所有碳青霉烯酶肠杆菌科菌均为MHT阳性，并且非碳青霉烯酶导致的碳青霉烯耐药菌株也可能MHT阳性。澄清了何时进行MHT：“修订的碳青霉烯酶评论”Reference:M100-S22;Table2A,pages45,53&57第38页，课件共80页，创作于2023年2月为什么CLSI再次更改厄他培南对肠杆菌科菌的折点？2011折点主要基于:当时已知的对肠杆菌科菌的MIC分布PK/PD数据综述(保守地定为S≤0.25µg/ml)非常有限的临床数据(没有病人的厄他培南MIC=0.5µg/ml)2012折点主要基于:进一步的数据表明厄他培南MIC为0.5µg/ml的菌株不产碳青霉烯酶进一步的PK/PD数据综述进一步的临床数据ESBL+大肠埃希菌厄他培南敏感(MIC=0.5)的临床反应39第39页，课件共80页，创作于2023年2月40CLSI

文件MIC(µg/ml)纸片扩散(mm)敏感中介耐药敏感中介耐药M100-S20(Jan.2010)≤24≥8≥1916-18≤15M100-S20U(June2010)≤0.250.5≥1≥2320-22≤19M100-S22(Jan2012)**≤0.51.0≥2≥2219-21≤183.重新修订厄他培南折点

(在2011年折点上进行修订)第40页，课件共80页，创作于2023年2月4.增加环丙沙星对伤寒沙门菌和肠道外沙门菌的折点故事….对于伤寒沙门菌和肠道外沙门菌感染，当菌株为“环丙沙星敏感性降低的菌株”时，环丙沙星的临床疗效较差。MICs为0.12–1.0µg/ml以往的版本提示这可以通过萘啶酸纸片扩散法试验检测。然而，目前有菌株通过携带新的耐药机制导致环丙沙星敏感性下降=无法用萘啶酸纸片扩散法试验简便地检测出。2012新的环丙沙星折点对于“中介”菌株的新注释修订对萘啶酸纸片扩散法试验的推荐

41References:Crumpetal.2008.AntimicrobAgentsChemother.52:1278 Parryetal.2010.AntimicrobAgentsChemother.54:5201第41页，课件共80页，创作于2023年2月假如氟喹诺酮类敏感，那么进行萘啶酸药敏试验以检测氟喹诺酮类降低的敏感性如果萘啶酸耐药…….通知临床医生…“该菌株可能无法通过氟喹诺酮类药物清除；建议咨询感染病专家.”42肠道外沙门菌:萘啶酸-旧的推荐Reference:M100-S21.Table2A.Page46.第42页，课件共80页，创作于2023年2月沙门菌属.

氟喹诺酮耐药基因型表型萘啶酸环丙沙星MIC(µg/ml)没有耐药基因常敏感≤0.06gyrA(单突变)1染色体常耐药0.12-1.0gyrA,gyrB(多突变)染色体耐药≥4qnr+/-;aac(6’)-lb-cr2

质粒

(新机制)常敏感0.12-1.0431低水平耐药(敏感性降低);用“标准”的肠杆菌科环丙沙星折点检测不出2qnr基因编码DNA解旋酶保护蛋白；aac(6’)1b-cr修饰喹诺酮使之不太有效。有报道伤寒沙门菌和肠外沙门菌可通过此类机制导致治疗反应性延迟。第43页，课件共80页，创作于2023年2月肠杆菌科菌:

2012环丙沙星折点

菌株DD(mm)MIC(µg/ml)敏感中介耐药敏感中介耐药肠杆菌科菌（除外伤寒沙门菌和肠外沙门菌）(与其他肠道菌一致)≥2116-20≤15≤12≥4伤寒沙门菌和肠外沙门菌≥3121-30≤20≤0.060.12-0.5≥144Reference:M100-S22.Table2A.Page482012新不必再用萘啶酸试验进行筛查第44页，课件共80页，创作于2023年2月伤寒沙门菌和肠外沙门菌:

环丙沙星检测最好测定环丙沙星MIC在2012年新折点要求的低MIC范围可能无法在某些自动化系统中实现考虑Etest?如果进行纸片扩散法试验，需同时进行萘啶酸和环丙沙星试验：萘啶酸适用于解旋酶突变菌株(gyrA)环丙沙星适用于质粒介导的基因突变对其他氟喹诺酮类药物（如左氧氟沙星）的折点正在评估中45第45页，课件共80页，创作于2023年2月铜绿假单胞菌1.Beta内酰胺类抗生素:以下药物折点降低:哌拉西林哌拉西林-他唑巴坦替卡西林替卡西林-克拉维酸2.碳青霉烯:以下药物折点降低:亚胺培南1美罗培南2增加多利培南3折点46第46页，课件共80页，创作于2023年2月47铜绿假单胞菌:

折点修改Agent旧M100-S21新M100-S22敏感中介耐药敏感中介耐药哌拉西林≤64-≥128≤1632-64≥128哌拉西林-他唑巴坦≤64/4-≥128/4≤16/432/4-64/4≥128/4替卡西林≤64-≥128≤1632-64≥128替卡西林-克拉维酸≤64/2-≥128/2≤16/232/2-64/2≥128/2Reference:M100-S22.Table2B-1.Page63对应的纸片扩散法折点也已修改.第47页，课件共80页，创作于2023年2月1.Beta内酰胺类药物折点降低:

铜绿假单胞菌MIC折点目前已与肠杆菌科菌一致(在纸片扩散法折点上有细微差别).当使用新的降低折点，菌株若敏感，则不需再联合治疗。.删除:表2B-1注释-“Rx:

对与bata内酰胺类敏感的菌株，需要用高剂量治疗铜绿假单胞菌引起的严重感染。对于此类感染，单药治疗可能导致临床失败。.”48第48页，课件共80页，创作于2023年2月49铜绿假单胞菌:

折点更新药物旧(M100-S21)新M100-S22敏感中介耐药敏感中介耐药多利培南None≤24≥8亚胺培南≤48≥16≤24≥8美罗培南≤48≥16≤24≥8Reference:M100-S22.Table2B-1.Page63相应的DD折点也已更改.第49页，课件共80页，创作于2023年2月葡萄球菌属青霉素试验50第50页，课件共80页，创作于2023年2月葡萄球菌属.–青霉素故事…..>90%的葡萄球菌对青霉素“耐药”青霉素极少考虑用于葡萄球菌感染的治疗…然而—，当青霉素“敏感”时，青霉素可考虑用于需长期治疗的感染类型（比如心内膜炎和骨髓炎）某些葡萄球菌通过MIC或纸片扩散法检测为敏感，但可能携带beta内酰胺酶并导致青霉素治疗失败。51第51页，课件共80页，创作于2023年2月葡萄球菌.–青霉素CLSI以往推荐:当下列情况时，报告青霉素“敏感”前需进行诱导beta内酰胺酶试验:

抑菌圈直径≥29mmMIC≤0.12µg/ml也可考虑进行blaZbeta内酰胺酶基因的PCR青霉素折点MIC(µg/ml)抑菌圈(mm)SIRSIR≤0.12-≥0.25≥29-≤2852Reference:M100-S21.Table2C.Page70第52页，课件共80页，创作于2023年2月诱导beta内酰胺酶试验53血平板传种菌株诱导:贴纸片以诱导beta内酰胺酶产生(e.g苯唑西林或头孢西丁)过夜孵育检测抑菌圈边缘的菌落假如BL阳性，报告青霉素耐药PosNeg第53页，课件共80页，创作于2023年2月金黄色葡萄球菌

β-内酰胺酶(BL)诱导头孢硝噻吩beta内酰胺酶试验常常可以，但不总能检测出葡萄球菌的beta内酰胺酶。其他beta内酰胺酶试验更加敏感:Cloverleaf试验青霉素抑菌圈边缘试验blaZ基因检测并非最佳blaZ编码beta内酰胺酶有多种blaZ基因型

54第54页，课件共80页，创作于2023年2月金黄色葡萄球菌

β-内酰胺酶(BL)研究348MSSA(低的青霉素MICs)由blaZ-PCR检测:303PCR阴性45PCR阳性方法:青霉素MICsBeta内酰胺酶表型试验头孢硝噻吩-Cefinase头孢硝噻吩-DryslideCloverleaf试验青霉素抑菌圈边缘试验55*StatensSerumInstitut(Denmark),CDC(Atlanta),MGH(Boston)第55页，课件共80页，创作于2023年2月金黄色葡萄球菌

β-内酰胺酶(BL)研究青霉素MIC(µg/ml)blaZ功能阴性阳性0.00820.016150.03218010.069050.1215170.251140.5

41.0

2.024.01303451blaZ阴性

而青霉素“耐药”23blaZ阳性而青霉素“敏感”Reference:CLSIAgendaBookJanuary2011.SR第56页，课件共80页，创作于2023年2月57Cloverleaf试验检测beta内酰胺酶阳性金葡菌5%羊血平板S.aureusATCC25923作为指示菌株1单位青霉素纸片阴性(青霉素敏感)菌株某些结果难以判读Reference:CLSIAgendaBookJanuary2011.

菌株A-D均为BL阳性ABCDBL阴性第57页，课件共80页，创作于2023年2月58金黄色葡萄球菌

纸片抑菌圈边缘试验(10U

青霉素纸片和标准纸片扩散法试验)模糊/“沙滩样”=Β内酰胺酶阴性,青霉素敏感锐利/“悬崖样”=Β内酰胺酶阳性,青霉素耐药S.aureusQC:

阴性-ATCC25923阳性-ATCC29213(补充QC)Reference:M100-S22.Table2CSupplementalTable1.Page83第58页，课件共80页，创作于2023年2月金黄色葡萄球菌

3实验室beta内酰胺酶研究结果(N=348)试验敏感性特异性Cefinase77%100%Dryslide88%100%Cloverleaf100%100%Penicillin抑菌圈边缘试验96%100%59Reference:CLSIAgendaBookJanuary,2011第59页，课件共80页，创作于2023年2月60青霉素MIC≤0.12µg/ml头孢硝噻吩beta内酰胺酶阳性报告青霉素“耐药”头孢硝噻吩beta内酰胺酶阴性进行青霉素抑菌圈边缘试验模糊边缘报告青霉素“敏感”锐利边缘报告青霉素“耐药”金黄色葡萄球菌

青霉素(MIC≤0.12µg/ml)报告注释:若常规进行纸片扩散法试验，则仅检测抑菌圈edge!M100-S22.Table2CSupplementalTable1.Page80第60页，课件共80页，创作于2023年2月葡萄球菌.–青霉素

选择策略假如青霉素“耐药”，报告结果假如青霉素“敏感”，隐藏结果并添加注释：“若需青霉素结果请联系实验室”若青霉素“敏感”且临床要求报告，则:金葡菌头孢硝噻吩试验，若阴性

青霉素抑菌圈边缘试验凝固酶阴性葡萄球菌(包括路登葡萄球菌)诱导性头孢硝噻吩试验61第61页，课件共80页，创作于2023年2月(此页已删除）痰培养需包括肺炎链球菌、、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌科细菌的分离，若标本被唾液严重污染，可以不鉴定全部细菌或不做药敏试验；呼吸道和耳鼻喉标本需能分离β溶血链球菌和嗜血杆菌属；支气管肺泡灌洗液和支气管镜检查标本需能定量培养。尿液常规进行定量培养（菌落计数），需能分离、鉴定革兰阳性和/或革兰阴性细菌。泌尿生殖道标本需有合适条件培养淋病奈瑟菌；阴道炎患者标本需进行革兰染色；如开展孕妇（怀孕35-37周）B群链球菌的筛查，药敏试验需包括林可霉素和红霉素。粪便标本需能分离、鉴定腹泻相关病原菌（如沙门菌属、志贺菌属、耶尔森杆菌属、弯曲菌属、肠出血性大肠杆菌、嗜水气单胞菌），结果报告需标明具体的细菌名称，如未检出沙门菌属、志贺菌属等；无症状携带者，常规使用增菌培养基或选择培养基；需能检测霍乱弧菌、艰难梭菌；粘性较低的培养标本，宜进行直接显微镜检查。年龄大于6个月，有抗菌药物治疗史的严重腹泻患者，粪便常规培养无异常发现时，可检测艰难梭菌毒素。脑脊液培养标本需立即处理，常规进行革兰染色，培养基和孵育条件确保能培养常见苛养菌（脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、产单核细胞李斯特菌、诺卡菌等）；需根据实验室制定的危急值处理规程报告阳性结果（包括显微镜检查结果）；抗原试验，无论结果为阳性还是阴性，需再进行细菌培养；最好有其他方法检测不能培养或难培养的细菌。第62页，课件共80页，创作于2023年2月分枝杆菌：标本应置密闭的防渗漏容器内；某些标本（如：尿液、脑脊液）抗酸染色应浓缩，所有标本培养前应浓缩。应以密闭试管置密封的离心架内离心。分枝杆菌：标本需置密闭的防渗漏容器内；某些标本（如：尿液、痰液）抗酸染色及培养前应浓缩。需以密闭的螺旋盖试管置密封的离心架内离心，以最大程度减少气溶胶危害。需进行原始标本涂片分枝杆菌荧光染色；常规培养在35-37℃，当临床有特殊说明（某些特殊菌属）时，可置30-32℃或42℃。标本量大时，至少接种2类培养基。需在收到标本24小时内报告抗酸染色结果。

第63页，课件共80页，创作于2023年2月真菌培养宜使用含和不含抗菌药物的两类培养基。如果在室温下培养，应每天监测并记录室温（22℃-26℃）。经空气传播有高度感染性的真菌标本、含菌丝体的真菌应在生物安全柜内处理。若采用平皿培养，应封盖。真菌：需选择适当的培养基和环境，以保证分离重要的致病菌，并尽量减少污染；分离和鉴定程序需包括直接镜检或染色镜检（如10％KOH，墨汁染色或吉姆萨染色）、合适的选择性培养基、孵育温度以及药敏试验。需准备两种培养基（含或不含抗菌药物）。如果在室温下培养，需每天监测并记录室温（22-26℃）以确定室温持续满足真菌的生长。

提供鉴定服务的实验室，需建立完善的真菌鉴定程序，包括玻片培养（必要时），生化反应，营养试验（必要时）。否则需送有条件的实验室鉴定。经空气传播有高度传染性的微生物标本、含菌丝体的真菌需在生物安全柜或安全罩内处理。若采用平板培养，需有适当的安全措施（如封盖），以防止平板意外打开。只有具备严格的、适当的安全措施才能进行玻片培养。第64页，课件共80页，创作于2023年2月病毒：培养时，应详细记录细胞类型、传代数、细胞来源、培养基及生长状况；应检测并记录培养基和稀释剂的无菌试验和pH；应监测细胞病变效应，以优化培养的最佳时间。应比较未经接种或接种无菌物质的单层细胞与接种临床标本的培养物。病毒：单层细胞应孵育一定时间，以满足相应病毒的生长要求；需详细记录细胞类型、传代数、细胞来源、培养基及生长状况；需检测并记录培养基和稀释剂的无菌试验和pH；需监测细胞病变效应，以优化培养的最佳时间。宜比较未经接种或接种无菌物质的单层细胞与接种临床标本的培养物。需建立程序，对定量血清试验的红细胞悬液进行检测并标准化。工作表和/或记录需显示试剂或参比血清的滴度（如果可能），以及检测结果的实际滴度。所有血清学试验检测抗原或抗体，需设立阳性和阴性对照。第65页，课件共80页，创作于2023年2月（此页已删除）寄生虫：实验室需与临床医师协商制定寄生虫常规检验操作规程并遵循，其中包括常规寄生虫学试验粪便标本的采集时间、次数、标本量。粪便显微镜检查虫卵和寄生虫，需包括浓缩过程和固定染色试验；新鲜稀便显微镜检查需包括直接湿片检查，以观察寄生虫的动力。血液寄生虫（疟原虫或其他血源性寄生虫）显微镜检查应制备厚血涂片和薄血涂片，阳性结果按《传染病法》中疫情报告程序上报。血涂片检验疟原虫阳性时，需同时报告鉴定结果。分子微生物学：每次患者标本核酸提取、准备过程（手工或自动化），需平行设立阴阳性质控。需规定并记录所有孵育（反应）温度。如果孵育温度超出规定范围，需在发报告前采取纠正措施。试验操作和结果报告需遵循制造商的建议，而不用其他试剂、探针取代。第66页，课件共80页，创作于2023年2月对我国法定传染病病原微生物的检验程序应满足如下要求：（a）检验程序应至少符合中华人民共和国卫生行业标准；（b）当培养过程中发现人间传染的高致病性病原微生物（依据«人间传染的病原微生物名录»）时，应按相关法规要求进行处理，或送至相应级别的生物安全实验室进行检验。（此页为新增）new!第67页，课件共80页，创作于2023年2月5.5.2应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果符合性进行验证。（新增内容）5.5.3除通用内容外，检验程序还应包括适宜的培养环境和足够的培养时间；初次分离用非选择性培养基的平板直径应不小于9cm，应只接种一份标本。5.5.2需制定程序验证所有环节，包括染色、试剂、培养基、抗血清和分析软件等符合预期性能。需规定特殊病原体的识别、隔离、报告，以及特殊处理程序。5.5.3除一般内容外，程序还需包括适宜的培养环境和足够的培养时间；非选择性培养基（平板直径大于9cm）宜只接种一份标本。需能够尽快完成白喉杆菌、气性坏疽菌群、炭疽杆菌、肉毒梭菌和破伤风杆菌检测；痰标本需进行常规涂片、革兰染色，以确定标本的可接受性或培养范围。new!第68页，课件共80页，创作于2023年2月5.5检验程序（续前）5.5.3.3微生物SOP特殊书写内容：气性坏疽（例：外科特色医院：产气荚膜）

：操作时防止气体膨胀

炭疽肉毒梭菌破伤风第69页，课件共80页，创作于2023年2月5.6检验程序的质量保证5.6.1实验室制定的内部质量控制程序应包括整个实验操作过程，如实验分析前、中、后（报告）。质量控制应满足如下要求：（a）使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测染色程序。（b）凝固酶、过氧化氢酶、氧化酶、β内酰胺酶，实验当日应做阴性和阳性质控，商业头孢菌素试剂的β内酰胺酶试验可遵循制造商的建议。诊断性抗血清试剂，实验当日至少应做多价血清阴性和阳性质控。定性试验试剂每次检测时应至少包括阳性和阴性质控菌株或样本。不含内质控的直接抗原检测试剂，实验当日应检测阳性和阴性质控。（c）实验室常规采用的药敏试验方法应以标准菌株连续检测20－30天，每一组药物/微生物超出参考范围（抑菌圈直径或MIC）的频率应小于1/20或2/30。此后，应每周使用标准菌株对药敏试验进行质控。应保存抗菌药物敏感性试验资料，并至少每年向临床医师报告。第70页，课件共80页，创作于2023年2月5.6质控（续前）药物敏感试验室内质控每周一次（首次连做20-30天，不合格1/20或3/30）注意事项：注意质控用菌种性状保持第71页，课件共80页，创作于2023年2月厌氧菌应以有效的方法检测厌氧培养环境（如以亚甲兰试条、厌氧菌或适当的程序检测厌氧系统的厌氧条件）。分枝杆菌抗酸染色应在实验当日用适当的阴性和阳性质控验证；荧光染色应每次实验以阴性和阳性质控验证。厌氧菌：需以有效的方法检测厌氧培养环境（如以亚甲兰试条、厌氧菌或适当的程序检测厌氧系统的厌氧条件）。当厌氧培养系统出现问题时，需及时处理，必要时通知送检者。分枝杆菌：抗酸染色需在实验的每天用适当的阳性和阴性质控验证；荧光染色需每次以阴性和阳性对照验证。第72页，课件共80页，创作于2023年2月真菌直接染色（如：抗酸染色，PA