谷蛋白提取实验

实验题目

小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的提取一、实验目的了解小麦HMW-GS提取及SDS原理掌握小麦HMW-GS提取及SDS方法小麦HMW-GS变异类型图1以中国春（CS）为基准的各种小麦HMW-GS的SDS

谱带及亚基的编号（a、b、c、d等）（Paynelawrence,1983）二、实验原理变性剂SDS破坏蛋白质分子结构。强还原剂巯基乙醇使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，裂解后的氨基酸侧链和SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本是相同的，但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。胶束在SDS中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。SDS电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。图1蛋白质样品用SDS和还原剂处理后解聚成亚基不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶。浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可为均一胶和梯度胶。本实验用的是均一胶。二、实验原理图2SDS不连续电泳（分离胶为均匀胶）2.实验试剂1样品提取母液:

6gSDS(十二烷基硫酸钠)+37.5ml0.5MTris-HCl（pH6.8）+30.0mg溴酚兰+17.4ml蒸馏水+30ml甘油2样品提取液:27.2ml样品提取母液+4.8mlβ-巯基乙醇+64ml蒸馏水31.5MTris-HCl(pH8.8)溶液:18.17gTris溶于40ml水中，加浓HCl调pH至8.8，定容到100ml40.5MTris-HCl(pH6.8)溶液:6.05gTris溶于40ml水中，加浓HCl调pH

至6.8，定容到100ml530%Acr(丙烯酰胺)-0.8%Bis(N,N-甲叉双丙烯酰胺)溶液:30gAcr+0.8gBis溶于40ml水中，定容到100ml610%SDS溶液:10gSDS加40ml蒸馏水溶解，定容到100ml71.5%过硫酸铵（AP）溶液:0.15gAP溶于10ml蒸馏水中，现用现配。8Tris-甘氨酸电极缓冲液:3.032gTris+1gSDS+14.4g甘氨酸,定至1000ml9考马斯亮兰染色液:250ml甲醇+100ml乙酸+0.6g考马斯亮兰+250ml蒸馏水10脱色液:50ml甲醇+50ml乙酸+400ml蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液四、实验步骤将小麦籽粒砸碎放入1.5ml离心管加入400ul50%异丙醇溶液，60℃水浴30min，其间摇晃2次。10000rpm离心3min，弃上清液重复以上步骤2次加入100ul提取液B1（50%异丙醇+0.3%二硫代苏糖醇），60℃水浴30min加入100ul提取液B2（50%异丙醇+1.4%（v/v）4-乙烯基吡啶），60℃水浴1h，10000rpm离心10min把160ul上清液转移到新的离心管中，并在其中加600ul丙酮，放在4℃1.5-2h10000rpm离心10min，弃上清液，在沉淀中加入100ul样品提取液，放置2h以上，沉淀充分溶解后即可使用。

五制胶与电泳（1）取一套或两套干净的制胶专用玻璃板，在制胶架上固定好（2）先按照表1的比例制好分离胶，摇匀后灌到玻璃板间，上端留2.5cm左右空间，加入蒸馏水；等待分离胶凝结的时间里，按表2的比例制好浓缩胶预工作液（加入前四项）表1分离胶工作液的配制试剂单板30%Acr-0.8%Bis溶液13.3ml1.5MTris-HCl（pH8.8）10.0ml10%SDS0.4ml蒸馏水13.3ml1.5%AP3.0mlTEMED30μl表2浓缩胶工作液的配制试剂双板30%Acr-0.8%Bis溶液2.5ml0.5MTris-HCl（pH6.8）5.0ml10%SDS200μl蒸馏水11.2ml1.5%AP1.0mlTEMED20μl五制胶与电泳（3）分离胶凝结后胶面与水面之间会出现清晰的界面，此时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶预工作液中加入表2中要求的1.5%AP及TEMED，混匀后灌进玻璃板内，迅速插入样梳（4）浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，在电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为4ul（5）接通电源，每板胶稳流12-15mA，指示剂出胶后再跑2h，停止电泳；（6）揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分离胶放到染色液内，染色15-30分钟（视染色液新旧而定）；然后用脱色液或水脱色至背景清晰。5102121718