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文档简介

紫外吸收法和Bradford法

检测蛋白质浓度

一、紫外吸收法

1、原理：

蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。

2、器材与试剂

（1）、器材

A.紫外分光光度计

B.坐标纸

C.恒温水浴

D.微量加样器

E.移液管

F.试管与试管架（2）、试剂A.9g/LNaCl溶液B.标准牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容至100毫升。C.待测血清样品1取血清0.1毫升，用生理盐水稀释至2.0毫升。3、操作

取3支试管按下表操作：

空白标准测定

标准蛋白（1mg/ml）01.00待测样品1（ml）001.0

生理盐水(ml)4.03.03.0

轻轻混匀放置5分钟，在２８０nm处以空白调零，测定各管光密度，计算蛋白含量．

计算公式：

测定O.D/标准O.DX标准浓度X稀释倍数

=待测样品蛋白浓度（mg/ml)

也可

分别测定各管280nm处的O.D值，以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。

根据未知蛋白的O.D值，可在标准曲线上查出该蛋白的浓度。

280nm/260nm吸收差法：

由于核酸在260nm处有吸收峰，同时测定280nm和260nm的光度值，然后计算出蛋白浓度。依生理盐水调零点，用经验公式计算蛋白浓度（简便但精确度稍差）

1.450x0.D280—0.745X0.D260

=蛋白浓度（mg/ml）

（2）0.14mol/L氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。(4)血清样品(已稀释200倍)(5)层析样品(前次层析实验分离的原液)(三）、操作（标准曲线制作）：

取7支试管按下表操作：

空白待测标1标2标3标4标5

标准蛋白（ml）0.20.40.60.81.0

待测样品2（ml）0.2

生理盐水（ml）1.00.80.80.60.40.20.0

CBB-G250(ml)5.05.05.05.05.05.05.0

最终蛋白浓度（微克/毫升）3.36.69.913.2

16.5

混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定血清和层析分离蛋白内的蛋白浓度

取2支试管分别从血清样品和

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