中药制剂分析新技术

中药制剂分析新技术第1页，课件共51页，创作于2023年2月中国药典中药分析方法发展趋势1977版药典收载显微鉴别1985版药典收载TLC鉴别1990版药典收载对照药材的TLC鉴别和色谱方法的含量测定2000版药典建立了以色谱法含量测定为主导的质控方法2005版药典大幅度增加HPLC方法，重视特征成分、活性成分的测定2010版药典增加了指纹图谱的测定趋势：新方法新技术不断引入中药的质量控制中。第2页，课件共51页，创作于2023年2月高效毛细管电泳2中药指纹图谱3中药化学指纹图谱技术、中药DNA指纹图谱技术现代色谱技术1顶空气相色谱法、超高效液相色谱、超临界流体色谱提纲OUTLINE第3页，课件共51页，创作于2023年2月§1现代色谱技术1、顶空气相色谱法（液上气相色谱法、顶空分析法）对样品基质上方的气体成分进行GC分析来测定这些组分在原样品中的含量顶空气相色谱的分类静态顶空GC动态顶空GC第4页，课件共51页，创作于2023年2月1、顶空气相色谱法主要特点：样品前处理简单检测限低可分析含量低、组成复杂的样品适用于易挥发或易分解或无法直接进样分析的液体或固体样品的分析§1现代色谱技术第5页，课件共51页，创作于2023年2月顶空气相色谱法应用实例顶空固相微萃取-气相色谱法测定鱼腥草注射液中甲基正壬酮含量样品制备：精密量取鱼腥草注射液1ml，置顶空取样瓶中，精密加入内标物溶液50μl，摇匀，密封，作为供试品溶液。色谱条件（略）顶空分析条件平衡温度为50℃，平衡时间为10分钟（快速搅拌下），阀、输送管及定量管温度为80℃，加压为13.8kPa，加压时间、充样时间和压力平衡时间均为0.15分钟，定量管为1.0ml。§1现代色谱技术第6页，课件共51页，创作于2023年2月§1现代色谱技术2、超高效液相色谱（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特点固定相双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团颗粒粒度小，仅为1.7μm耐压，颗粒度分布范围很窄第7页，课件共51页，创作于2023年2月§1现代色谱技术2、超高效液相色谱（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特点检测器响应快样品池—10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一）优点更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏度，速度、灵敏度及分离度，分别是HPLC的9倍、1.7倍及3倍第8页，课件共51页，创作于2023年2月样品的前处理分子印迹技术制备对特定目标分子具有分子识别性能的分子印迹聚合物的技术。分子印迹聚合物兼备了生物识别体系和化学识别体系的优点,具有抗恶劣环境、选择性高、稳定性好、机械强度高、制备简单等特点,可选择性识别富集复杂样品中的目标物。用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等样品前处理技术。第9页，课件共51页，创作于2023年2月§1现代色谱技术3、超临界流体色谱（SFC,supercriticalfluidchromatography）以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为流动相。对GC及HPLC的检测器均可兼容使用适用于分析GC难以处理的高沸点、不挥发性样品分离速度较HPLC，分离效果更好。应用实例超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量第10页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳电泳:在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年Tiselius(瑞典)利用自由溶液电泳将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白1981年Jorgenson和Luckas发展了高效毛细管电泳分离分析技术(使用75μm内径石英毛细管和采用了高达数千伏的电压)，第11页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

ν+=ν电渗流

+ν+ef

阳离子运动方向与电渗流一致

ν-=ν电渗流

-ν-ef

阴离子运动方向与电渗流相反

ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致

可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离分离原理电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。

第12页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳仪器装置电压：0～30KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器可检测到：10-19～10-21mol/L第13页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳主要特点优点高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液第14页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳常见的毛细管电泳模式毛细管区带电泳(CZE)毛细管胶束电动色谱(MECC)（胶束作为假固定相的电动色谱）毛细管凝胶电泳(CGE)（凝胶作为支持物，起分子筛的作用）毛细管等电聚焦电泳(CIEF)（用于蛋白质、多肽等两性物质的分离）毛细管等速电泳(CITP)第15页，课件共51页，创作于2023年2月§2高效毛细管电泳应用离子分析药物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA测序HPCE在中药制剂分析中的应用生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱第16页，课件共51页，创作于2023年2月高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量对照品溶液（略）供试品溶液的配制取心舒口服液10mL，加热浓缩至约1mL，加60%甲醇定容10mL，冰箱放置过夜，经0.45mm滤膜滤过备用。电泳条件以熔融石英毛细管(50mm×66.5cm，有效分离长度58cm)为分离通道，以105mmol/L硼砂液为运行缓冲液，压力进样50mpa，6s，毛细管柱温度为20℃，运行电压为0～30min:24kV，30～60min:28kV，检测波长为210nm，毛细管柱使用前以0.1mol/L氢氧化钠溶液、注射用水和运行缓冲液依次冲洗5,5,8min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8min。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。第17页，课件共51页，创作于2023年2月§3中药指纹图谱

从整体上评价中药的内在质量中药（化学）指纹图谱法现代光谱（红外光谱，紫外光谱）色谱（气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳）其它（X光衍射）第18页，课件共51页，创作于2023年2月§3中药指纹图谱中药DNA指纹图谱法——DNA分子遗传标记

DNA分子：遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠90年代，PCR(PolymoraseChainReaction)技术，快速而灵敏地检测。近年来，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测DNA多态性的分子标记技术（DNA指纹技术）。应用：在药材鉴定方面第19页，课件共51页，创作于2023年2月广义的分子标记（molecularmarker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。DNA序列测定第20页，课件共51页，创作于2023年2月基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）第21页，课件共51页，创作于2023年2月2、DNA扩增产物指纹分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、特征扩增区段测序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。第22页，课件共51页，创作于2023年2月RFLP技术及其应用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。第23页，课件共51页，创作于2023年2月基本原理

生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,简称RFLP)第24页，课件共51页，创作于2023年2月RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCT第25页，课件共51页，创作于2023年2月第26页，课件共51页，创作于2023年2月DNA多态性根据其产生的两种基本方式碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的。第27页，课件共51页，创作于2023年2月第28页，课件共51页，创作于2023年2月RFLP与镰状细胞贫血第29页，课件共51页，创作于2023年2月基本实验步骤靶DNA的准备核酸探针的标记杂交显示第30页，课件共51页，创作于2023年2月RFLP的优点及局限性

优点：

(1)普遍存在

(2)稳定性

(3)共显性

(4)探针与限制酶的组合数量无限局限性：（1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变（2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多（3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别（4）限制性内切酶价格较贵

第31页，课件共51页，创作于2023年2月RFLP用于亲缘关系分析“Ladder”第32页，课件共51页，创作于2023年2月RFLP在中药材鉴别中的应用

（一）近缘种的鉴别如：海马的PCR-RFLP分析

（二）药用植物亲缘关系的研究如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生物碱分布的关系

第33页，课件共51页，创作于2023年2月RAPD技术及其应用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。第34页，课件共51页，创作于2023年2月RAPD技术基本原理RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物为20～30个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。第35页，课件共51页，创作于2023年2月RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA第36页，课件共51页，创作于2023年2月基本实验步骤

模板DNA的制备PCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93℃预变性200s，开始如下循环：94℃变性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；经过40个循环后，72℃延伸5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。扩增产物20μl反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况RAPD图谱的数据处理第37页，课件共51页，创作于2023年2月RAPD分析的优越性和不足优越性：

(1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸；

(2)扩增没有特异性；

(3)退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。

(4)简便易行，省力省时。（5）检测灵敏方便；（6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自动化。第38页，课件共51页，创作于2023年2月不足：（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36℃),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；（3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。第39页，课件共51页，创作于2023年2月RAPD分析在中药研究中的应用

道地药材的评价

例：当归药材道地性的RAPD分析野生与栽培种及不同农家品种亲缘关系分析例：人参及山参RAPD指纹动物药的鉴定

例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究第40页，课件共51页，创作于2023年2月AFLP技术及其应用

扩增酶切片段多态性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。第41页，课件共51页，创作于2023年2月AFLP基本原理

AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificialadapter）,与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。第42页，课件共51页，创作于2023年2月基本实验步骤

模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters）限制性片段的选择性扩增（Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments）扩增产物凝胶电泳分析（Gelanalysisoftheamplifiedfragments）第43页，课件共51页，创作于2023年2月AFLP的实验过程第44页，课件共51页，创作于2023年2月AFLP反应流程：AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这