基因工程抗体

基因工程抗体研究进展及其临床应用林晓虹摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体.近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力.关键词：抗体；基因工程抗体；噬菌体抗体库转基因技术迅速发展，其应用和发展的领域日益夸大。但转基因技术的弊端日益凸现，引起众多关注的目光。就转基因技术本身而言，社会各界对它的态度各有异同。不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。如何看待转基因技术？如何去应用和发展转基因技术？这些都是我们亟待解决的问题基因工程抗体介绍基因工程简介基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在 80年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。基因工程抗体种类基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。.嵌合抗体嵌合抗体(chimericatibody)是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。.人源性抗体是将人抗体的CDR代之以鼠源性单克隆抗体的CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。.完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。.单链抗体是将Ig的H链和L链的V区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV(singlechainfragmentofvariableregion,sFv)。SFv穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

.双特异性抗体将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL细胞、NK细胞、LAK细胞）表面分子的抗体（CD3抗体或CD16抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。1基因工程抗体发展细胞内抗体最近，美国FDA强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础的药剂设计成为可能。成份复杂，副反应.产重况物多亮隆沆E清 k被抗生素所代替1975年，杂交瘤技

未制备单抗成氐HAMA反应鼠源中.克隆把体 "魔弹’1975年，杂交瘤技

未制备单抗成氐HAMA反应鼠源中.克隆把体 "魔弹’分子生物学

分子生物学

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及形式多样的改造抗域抗体I.程就是指利月分子生物学、基因工程等手段对汨本正行各村不问的孜造尹在原核、真核约胞中表达制备的工•程技.术’鼠源项体笊人源化

及形式多样的改造抗域图I:抗体的发展2.制备基因工程抗体的基本技术路线从宏观上看，目前基因工程抗体主要在酵母、大肠杆菌、动物非淋巴细胞中表达有功能活性的Ig。其生产的技术路线与重组性细胞因子相类似，但由于抗体分子结构复杂，并且具有自己的一些特性。因此，基因工程抗体的操作过程也有自己一些独特的地方。在技术上包括三大环节：①分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立；②构建McAb的基因文库及其表达载体；③转化到非淋巴细胞中进行表达。（一）抗体基因的克隆及重组进行基因工程抗体制备的首要任务是获得能表达抗体肽链的基因片段。C区基因的序列比较恒定，可以很容易地获得，关键是准确地获得编码抗体可变区（特别是抗原结合位点区）的基因。目前可能从分泌特异性抗体的杂交瘤株的cDNA文库和基因组文库中进行筛选。正常情况下V区基因不表达，只有经过重排使VJ相连接后的基因才可以表达出具有抗原结合能力的Fv段。因此，人们勿需事先弄清V区的氨基酸排列顺序，只需使用J链基因（该基因的核苷酸序列变异小，可用于共用探针）探针即可从构建的cDNA文库中筛选出含V区基因外显子的基因克隆。遗憾的是，杂交瘤细胞系经常会有一些异常重排的V区基因，其中的部分还可以具有转录活性。因此为获得正确的目的基因，还有必要进一步的鉴定。利用基因组文库的优点在于所获得的V区基因含有完整的转录单位，包括自身的起动子、增强子成分及剪接功能，有助于重组后的顺利高效表达。而利用cDNA文库时（由于不含较长的内含子序列），可通过PCR技术合成较多的V区基因，较容易获得目的基因。Ig的V基因和C基因均由不同的外显子构成，抗体的每个功能区蛋白均由独自的外显子编码，这给体外加工和重组抗体基因组V和C区的基因带来了便利，可较容易地进行缺失（dalating）、插入（inserting）、交换（exchanging）及改变外显子的次序。（二）抗体基因表达载体的构建为了能运载Ig基因，并得以在持续稳定转染的相容细胞中分泌表达，必须构建相应的真核表达载体质粒，这种质粒须具备如下特点：①具备完整的真核转录单位，可以整合到宿主细胞染色体中，并表达或能自行复制其DNA；②因为只有约103〜106的真核细胞被转染，因此要从中筛选出被转染的阳性表达细胞，所以该质粒应具备选择性基因标记，其基因产物可在选择性培养基中进行鉴别；③其DNA片段容易被修饰，可进行适宜的插入或剪接；④内含适宜的限制酶的酶切位点，使适宜的DNA片段容易克隆。根据表达时选用的受体细胞类型，可构建各自相应的载体。为生产出具有功能活性的新型抗体分子，需将编码轻、重链的H和L基因同时导入受体细胞，并使之等量（或接近等量）地表达和装配。目前采用了两种方法：①分别构建表达H基因和L基因的载体，并用两个载体同时转染受体细胞，该法便于遗传学操作，但只有两种载体同时转染成功并产生等量轻、重链时，才能有效地装配成功能性抗体，因此两种载体应载有不同的抗性基因（多采用neo基因-转染的细胞表现为G418抗性和gpt基因转染的细胞表现为霉酚酸mycophenolicacid抗性），并同时使用两种制剂做双重抗性筛选；②将轻、重链基因插入同一载体，该法利于筛选，但插入的基因序列过长，给基因操作带来一定的困难。（三）抗体基因的表达抗体结构较复杂，与其他单链蛋白或多肽（如细胞因子等）相比，高效表达功能性抗体分子尚有很大困难。目前，许多学者主要是利用哺乳类动物非淋巴细胞，导入用质粒重组的目的基因，表达后，制备基因工程抗体，这是目前制备这类抗体的主要方法。3.抗体药物发展现状1.FDA已批准上市的抗体药物。2.SFDA（中国）已批准上市及临床研究的的抗体药物。4工程抗体的未来发展与展望1单克隆抗体的市场需求MOOO1200&治疗美节炎根用牺器炎矩—feffi 感染性疾病MOOO1200&治疗美节炎根用牺器炎矩—feffi 感染性疾病一呼吸瘦病——止由 里啊——心血修建病克2004—2011年全球治疗i°°的单抗市场的预测及分析颂。6000400E基因工程抗体药物的应用随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，并在医学领域的许多方面都具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾基因工程抗体的临床应用.基因工程抗体构建形式灵活多样，不仅能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性，而且可以将抗体的部分片段与其它功能性分子连接，使抗体除了与抗原结合外，还能发挥其他效应分子的生物学作用。基因工程抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，显像效果受抗体亲和力、特异性、半衰期和组织穿透力等因素影响。同时，用鼠源单抗会引起人抗鼠抗体反应，改变抗体药物代谢动力学而导致显像失败，并产生副作用。用基因工程抗体可解决上述问题，而且基因工程抗体中如单链抗体、F（ab’）等，分子量小、能很快清除、组织穿透力强，显像本底低，更加适合放射免疫显像。恶性肿瘤的导向治疗是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体，与毒性蛋白如绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素及白喉毒素等，或是细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子、干扰素等融合形成的重组毒素或免疫毒素可将细胞杀伤效应引导到肿瘤部位，对肿瘤细胞进行直接杀伤或调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞.2基因工程抗体的抗感染作用预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素，但对于

如SARS、AIDS等难以获得相应疫苗或疫苗效果不理想的病毒感染，目前仍缺乏有效的治疗方法。在这一方面，基因工程抗体应用前景十分广阔。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2-19，对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为AIDS基因治疗的有效手段。Seko等［6］利用抗CD40L/B7-1McAb从对急性病毒性心肌炎进行研究，结果表明该McAb能够明显减轻心肌炎症、预防心肌损害。另外，Ryu等［7］实验研究表明，抗HBV表面抗原的人-鼠嵌合抗体能够明显中和乙肝病毒，比人乙肝病毒免疫球蛋白的活性高出2000倍。HCV核完全蛋白的噬菌体ScFv也能够有效地抑制HCV对浆细胞的感染。我国率先建立了针对SARS的基因工程抗体库，这对于SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。3基因工程抗体在器官移植中的应用移植排斥反应是器官移植的主要障碍之一。T淋巴细胞和细胞因子在急性排斥反应中所起的核心作用已经被公认。虽然，现有的免疫抑制剂能有效地控制75%〜85%的急性排斥反应。但随着病人长期存活率的提高，他们将面临真菌感染、病毒感染和肿瘤等危险。基因工程抗体在这一领域也崭露头角，其中抗CD3及抗IL-2基因工程抗体的研究较为多见。目前，MurmonabCD3和Anti-IL-2R已被FDA批准用于预防器官移植排斥反应并取得了较好的疗效。基因工程抗体不仅在上述疾病中有着重要的应用，而且在自身免疫性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病等的治疗方面也显示出独特的优势。小结基因工程抗体技术已深入到生物学和医学的许多领域，并成为一项必不可少的工具，具有非常重要的理论研究价值和实用价值。目前，该技术不仅可用于戒毒、血液性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官移植、肿瘤、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊疗，而且在蛋白质纯化工程中也有广阔的应用前景。参考网址：/html/qikan/lcyx