免疫组化实验课课件

免疫组化实验课41、俯仰终宇宙，不乐复何如。42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。44、欲言无予和，挥杯劝孤影。45、盛年不重来，一日难再晨。及时当勉励，岁月不待人。免疫组化实验课免疫组化实验课41、俯仰终宇宙，不乐复何如。42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。44、欲言无予和，挥杯劝孤影。45、盛年不重来，一日难再晨。及时当勉励，岁月不待人。免疫组织化学实验课计划赵坤庆赵清杰中国科学院动物研究所Email：zhaokqioz.aczhaoqingjie11mails.gucas.ac实验一实验动物取样、固定与保存（4学时）实验室规章制度及实验室安全讲解学生分组分小组配置相关溶液：操作动物的致死法及取材:操作细胞标本的制备：操作尸体解剖的取材：讲解活检标本的取材：讲解组织样品的固定：操作一、引言英语写作是较高层次的语言技能，大学英语写作教学效果不显著。为了应对四、六级考试，教师讲写作技巧，学生按照三段论的套路填空，然后教师对作文进行精批细讲，结果学生因体会不到创作的乐趣而对写作失去信心，教师则因批改作文而力不从心。在这种情况下，写作教学收效甚微，学生的写作能力很难得到提高，英语水平自然达不到理想的状态。民办高校的大学英语写作教学也是如此。民办高校非英语专业学生具有自身的特点，他们英语词汇量偏小、语法基础薄弱，对英语写作及英语学习存在焦虑情绪，学习积极性不高，自我认可度不高。此外，民办高校非英语专业的英语课课时紧、内容多，教师很难对学生的写作进行全面详细的指导，学生的写作能力难以得到全面提高。王初明教授提出的“写长法”是以写的方式促进外语教学的方法。该方法强调通过写长增加学生语言输出的量，提高学生的写作水平。自写长法理论提出以来，诸多学者从不同方面对其进行了大量的研究，包括理论探讨和实证研究。实证研究中，有些是以高中学生为研究对象，还有些是以英语专业的大学生、非英语专业的大学生和高职的学生为研究对象。以民办高校非英语专业大学生为研究对象的相关研究鲜有人为。因此本文以写长法理论为基础，以民办高校非英语专业的学生为研究对象，运用SPSS软件分析数据，探讨写长法在大学英语教学中的应用效果。二、理论基础（一）可理解输出假设写长法的理论依据是Swain的输出假设理论。Swain认为，学习者必须经过大量的语言输出实践才能内化输入的语言，输出有强化流利性程度的功能。她提出了输出在促进准确性方面的三个功能：“注意”的功能、假设检验和有意识的反顾。学习者因他人的提醒或自发思考注意到不同语言形式的使用，这使他反过来检查自己使用的语言；如果仍不能修正自己的错误，他将转向输入以获得更多的信息。Skehan认为协调输出可以得到学习者目前语言同等水平的输入，即输出可以产生更好的输入。写长法通过输出量的积累，促进学习者输入的量，以量促质；同时，大量的写作体验可以使学生获得学习成就感，增强信心，从而能够提高输出的质。（二）写长法理论写长法革新传统的写作教学方法，通过大量的写长练习，以数量促进质量，实现学生写作水平由量到质的飞跃。该方法的教学理念是打开学习者的情感通道，淡化学习写作，激发学习者兴趣，挖掘其自身的学习潜力。该方法强调写作任务的设计必须能够激发学习者的兴趣，教师在批改作文时发现闪光点，淡化错误的修改，少讲写作方法，让学生从写作中悟出写法，这既可以增强学生的信心，也能够减轻教师的负担。三、实验（一）研究问题写长法教学是否促进了民办高校非英语专业学生作文水平的提高？是否促进学生英语学习水平的提高？（二）研究对象本研究选取的受试为山东协和学院2012级非英语专业大一两个本科班的63名学生，其中实验班31人，对照班32人，男女学生比例基本相当，他们已经在本校进行了一学期的英语学习。本学期是第二学期，所用教材是全新版大学英语第二册。大学英语没有设专门的写作课，写作是精读课的一部分。前测成绩来源于实验前对两个班的学生进行的英语作文测试成绩和第一学期期末英语考试成绩，试卷满分均为100分。然后运用IBMSPSSStatistics19对实验班和对照班的作文测试成绩和第一学期期末英语考试成绩进行独立样本T检验分析，结果显示两个班的英语作文测试平均成绩没有显著差异（t=0.362，p=0.65），第一学期期末英语考试平均成绩也没有显著差异（t=1.076，p=0.286）。实验班和对照班由同一名教师教授，实验班接受写长法英语教学，而对照班接受传统的作文教学方法，实验为期一学期。前测和后测作文试卷由同一位教师批阅。前测作文成绩、第一学期期末英语成绩、后测作文成绩以及第二学期期末英语考试成绩将作为衡量英语水平的依据。（三）实验的方法与步骤1.写作任务的设计。写作任务直接决定着语言输出的质量，写作任务必须能让学习者愿意写、有的写，能够写得长，必须是学习者感兴趣的话题。因此本研究在选取写作任务时精挑细选，从几个教全新版大学英语的教师选出的题目中进行第二轮的挑选；这些题目都是跟精读课文内容紧密相关，在课上经过讨论的；或者是由教师提供读物让学生写读后感，教师同时提供重点词汇、短语和句型供学生使用，以读促写长。题目的设计考虑到了学生具备的背景知识以及他们的英语表达能力，多是些学生感兴趣的话题，比如一次难忘的经历，由于印象比较深刻，有东西可写，学生往往愿意写，也能够写长。同时，鼓励学生到图书馆查阅资料、增大他们的阅读量，扩大背景知识和信息量，使读写相长。写作长度的下限一开始定为150词，逐渐增加到200词、300词，甚至更长。作文任务由教师课内布置，由学生课外完成，每两周完成一篇作文。教师要求上交作文前，学生至少检查作文两遍，然后与同学交换检查。这样既避免了低级错误的发生，又促进了同学之间的相互学习。教师从作文长度（40分）、作文结构（20）、作文思想（20）和语言表达（20）四个方面打分，教师点出作文中的闪光点，以及学生使用的新的表达方法；尽量避免批改错误，可以点出错误，让学生自己修改或同学帮助修改；最后选出两篇优秀作文在课内集体评阅。整个过程中，教师要淡化错误，强调闪光点，让学生有信心、有兴趣继续写。2.数据的收集与分析。经过一个学期的写长法实验，对实验班和对照班的学生进行一次英语作文测试，作文满分为100分。将两个班学生的后测英语作文成绩及第二学期期末英语考试成绩分别进行比较。期末英语考试的总分为100分，其中作文占15分。表2显示实验班和对照班的后测作文平均分分别为79.34和76.28，两个班的作文成绩有显著性差异（t=2.298，p小学语文新课程标准指出，要注重语文的熏陶感染作用，引导学生多读书，好读书，读好书，帮助学生构建健康的审美情趣，形成正确的人生态度和价值观念。对于小学生来说，阅读不仅可以提高小学生的学习成绩、开拓小学生的知识视野，还能在一定程度上提高写作能力，成为个体今后生存发展的重要技能。因而教师要探索更多适合小学生阅读实际的教学方式，提高小学生阅读能力。一、小学语文阅读教学现状1.阅读教学载体缺乏创新小学生的身心发育尚不够成熟，认知能力较为薄弱，对事物缺乏精确的感知，注意力也缺乏稳定持久性，认识事物往往始于好奇心、终于兴趣，然而，小学语文阅读教学又是从字词句概念入手，向篇章阅读过过渡，这种枯燥的教学模式本身就在消耗着学生的好奇心，以说教为主的课堂模式更是让学生视阅读为完成任务，根本提不起阅读兴趣，再加上小学生自身的关注力有限，影响阅读能力的同时也对构建小学生的思维体系造成困扰。[1]2.课外阅读导向缺乏标准作为阅读教学的扩充模式，课外阅读在新课程改革深入实施的当下，已经引起了多数教师的高度关注，能够为学生列出符合年龄特征的课外书目，提出一些基本的阅读要求，但是，仍然有一部分教师对待课外阅读的认识不够清晰，把课外阅读视为一种可有可无的阅读教学方式，偶尔为学生推荐几本课外参考读物，不布置任何阅读要求，学生对文章字句段落的理解情况、情绪情感体验如何也不做相应记录，阅读习惯难以形成，这些都是课外阅读盲目性的体现，使得一些学生表面看来是进行了课外阅读，但却收效甚微。[2]二、培养小学生阅读能力的策略1.以培养兴趣为抓手，引导学生走近阅读俗话说，兴趣是最好的老师，培养小学生的阅读能力也应当以提高阅读兴趣为基本着力点，结合小学生身心发育特征，探索发现小学生阅读兴趣的基本规律。教师可以选择一些趣味性十足的阅读材料，如《哈利波特》、《了不起的小叶子》等等，让学生对这些材料展开阅读，吸引小学生对阅读的初始注意力，并在教学过程中将这些趣味性材料与教材中的阅读内容相互融合，进一步激发学生的阅读兴趣，实现阅读能力的基础性构建。2.以革新理念为核心，带动学生参与阅读在进行阅读教学时，要摒弃预先设置问题的方式，让学生进行初步阅读，在这个过程中自主发现问题并记录下来，进入到熟读材料的阶段，在熟读材料的过程中，体会字词句段落大意，把握文章基本架构，带着自主发现的问题，理解文章的主题，了解作者的写作技巧以及文章编排方式，在精读过程中，体会字里行间作者流露出的情绪情感，关照自身的情感体验，真正实现对灵魂的洗涤。这样的阅读理念让教师的主导地位逐渐削弱，成为学生阅读程度逐渐递进的引导者，让学生脱离了被动接受的学习地位，自主发现问题，在自主阅读以及教师引导中自主解决问题，加深了情绪情感体验，对文章的理解也更加深刻，久而久之能够收获一定的阅读技巧，积累相应的阅读经验。3.以丰富教学手段为关键，敦促学生享受阅读在进行阅读教学时，教师应当结合小学生形象思维发育比较成熟的特点，进行阅读教学手段的革新。教师可以采用翻转课堂模式，在课前录制好阅读课程教学视频，要求学生对这些阅读视频进行预习，整理并记录阅读问题，在课程进行中，开展师生互动、生生讨论，得到答案的同时在互动过程中体会到不同的阅读理解及情感体验，达到创新性阅读及人文素养的培育；对于低年级学生，教师可以采用游戏的方式，把阅读内容穿插到游戏过程中，设置特定情境让学生进行角色扮演，在不知不觉中获取知识培养阅读能力，比如在讲解《我不是最弱小的》一课中，让学生分别扮演妈妈和萨沙，体会妈妈心中弱小的萨沙和萨沙心中自己是勇敢者的感受，在角色体验中获得情绪情感共鸣，达到潜移默化的阅读效果；教还可以运用多媒体技术，以声形并茂的流动画面，刺激学生的感官，让学生如身临其境般感受画面中的意境，从而拓展想象空间，获得情感体验，在阅读中更易于贴近作者写作中的心灵感受。[3]4.以创新课外阅读为补充，辅助学生爱上阅读要解决课外阅读中存在的盲目性，教师就要充分认识到课外阅读的重要性，发挥引导性作用为学生的课外阅读制定规划。要以学生的年龄特点为依据选择相适应的课外读物，在此基础上提出合理的阅读要求，比如，限定阅读时间，开展“图书漂流”活动，根据课外读物中摘抄的内容办班级板报，评选优秀的板报作品等等；要规划出特定时间对某一课外读物进行集中解读，解答学生阅读中普遍存在的难点问题，开展小组合作学习让每个学生说明自己的见解，奖励对这一课外读物理解相对到位的学生，形成激励机制，鼓励学生积极参与到课外阅读中，养成自主阅读的好习惯；还要开展相应的语文阅读实践活动，挑选以大自然为主题的课外书目，如《神奇的动物》、《科学与常识》等等，让学生在自主阅读中发现问题，教师安排固定时间引导学生走进大自然，观察自然界动植物特性，自主寻找答案，同时也开阔了视野，增长了见识，能够以更加充分饱满的情感体验参与到接下来的阅读当中。结语总而言之，改变传统的阅读教学理念，不断丰富教学手段是当前小学语文教学最重要的任务，是国家教育事业发展的重要组成部分。随着教学方式的不断改革，传统的教学方式已经无法满足当代小学生的学习需要，在现阶段的小学语文教学过程中必须坚持“以生为本”的教学原则，利用对话交流提高小学生的阅读积极性，让小学生在阅读的过程中充分发挥主动性，为实现终身阅读奠定基础。分小组配置相关溶液1配制10XPBS及1XPBS10×PhosphateBufferedSolution（PBS）(pH7.4)：ReagentWeightFinalconcentrationNaClMW=58.4481.816g1.4MKClMW=74.552.01g27mMNa2HPO4·12H2OMW=358.1435.8g100mMKH2PO4MW=136.092.45g18mMH2OUpto1000ml注：1000ml溶液用约1ml10MNaOH调节pH值至7.4。因为实验室所用蒸馏水、三蒸水和去离子水的本底pH值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。2配制1NHCl，1NNaOH3配制组织固定液：4%PFA4配制热修复液：Tris-EDTA5配制梯度酒精：75%，85%，95%6酒精：二甲苯=1:17石蜡：二甲苯=1:1分小组配置相关溶液动物的致死法动物处死方法：

1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥静注

2.空气栓塞法

3.断头法

4.断颈法

5.二氧化碳窒息法

病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。尸检组织的取材

抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。

组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。手术切除标本的取材

1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响

刀和剪要快，刀要足够长。

3.组织块的大小

厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定

4.组织的取材位置

要视研究目的，观察部位而定5.取材时间

原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织取材注意事项

培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将

（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。

（2）将细胞直接培养在盖玻片上。

（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。活细胞标本的制备法

目的

(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。

(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。

（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织标本的固定

(1)甲醛固定液

10％福尔马林

(2)4％多聚甲醛固定液

(3)BouinS液及改良BouinS液

固定液的种类(1)大小2cm×2cm×0.3cm

(2)及时固定(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。

(4)组织固定后必须彻底冲洗。固定方法的选择及注意事项实验步骤组织取材与细胞制备。组织取材：小鼠子宫、淋巴结、胸腺、脾、骨髓。组织洗涤。将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果；组织固定。所取材料于4％多聚甲醛中固定24小时（固定的时间依组织大小而定，组织较大可固定较长时间，如果一开始分小块固定，则固定时间应缩短，约6小时）；组织脱水。分别用50％和70％酒精脱水1h，样品在70％酒精中置于4℃保存直至石蜡包埋；梯度脱水。组织块从70％酒精中取出，在80％、95%、100％、100％酒精中各脱水1h；透明。组织块在100％酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜；浸蜡。包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h；实验完毕整理实验室及实验台实验二组织包埋与切片及HE染色（4学时）实验内容：1经脱水，透明，浸蜡的组织样品进行包埋：操作2包埋样品的切片：石蜡切片3切片的HE染色：目的：

由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支撑,才使组织能用于石蜡切片。组织脱水、浸蜡及包埋(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ

(4)石蜡包埋：修蜡块，标号常规石蜡包埋过程一般的组织化学染色切片厚度要求在5～7µm左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在20～100µm之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有：冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。

组织切片⑴骤冷（Quenching）骤冷的目的①最主要的目的是防止标本内的水结成冰晶——破坏标本结构。②杀死组织（细胞）。③快捷制片。冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。它的突出特点：能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性。

冰冻切片⑵切片骤冷后的组织块切片机上切片，目前的切片机有两类：1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、

甲醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片机）。开放式冰冻切片机由于暴露于空气中，温度不易控制，技术难度大，现多已淘汰。2）恒温冰冻切片机（Cryastat）——常用

恒温冰冻切片机切片后如不染色，必须冷风吹干，贮存于低温冰箱内或短暂预固定后，冰箱贮存。

冰冻切片LEICA冰冻切片机石蜡切片LeicaRM2235RotaryMicrotome

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）(7)冰冻切片后需凉干后立即固定

(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。

(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用切片要求及注意事项包埋。在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡，置于热台，将组织用镊子放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，凉台冷冻，浇蜡，冷冻，直至整个蜡块成型。置于凉台，待石蜡彻底凝固后，利用切片托将蜡块取出。组织切片。把切片刀架上，固定紧，然后利用切片托将蜡块在切片机固定器上夹紧。若位置不够平，可调整切片台的位置，同时修块。切片时，一开始可以将厚度调整至20μm。右手匀速转动手柄，直到把组织全部切出，这时将厚度调为5μm，继续切片。蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用载玻片捞起，晾干，放入切片盒。37℃烤片过夜。石蜡包埋及切片实验步骤HE染色法，即是苏木精-伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都不强，则称中性。一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来。是形态学最常用的染色方法。HE染色HE染色步骤试剂时间×次数1二甲苯10min×32100％酒精5min×3395％酒精5min×1485％酒精5min×1570％酒精5min×1650％酒精5min×17蒸馏水5min×38苏木精染液10min9自来水（缓流水）10min10蒸馏水2min×1111％HCl分色1-2s（浸入即取出）12自来水（缓流水）立即冲净13蒸馏水2min×1140.1％氨水

返蓝2-2.5min15蒸馏水2min×11650％酒精5min×11770％酒精5min×11885％酒精5min×119伊红染液20s2095％酒精

脱浮色5min×12195％酒精

5min×122100％酒精5min×323二甲苯10min×324二甲苯&封片剂封片25通风橱晾干4h或过夜实验三免疫组化染色（4学时）实验内容：1免疫组化原理2免疫组化操作免疫组化原理抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。对照染色的目的假阴性的原因主要有：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：对照的种类及其选用目的阳