植物细胞工程的基本原理和技术基础

关于植物细胞工程的基本原理和技术基础第1页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

4.1植物细胞工程的基本原理

4.2植物细胞和组织培养所需条件

4.3外植体的选择及消毒

4.4外植体的切取和培养

第2页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

植物细胞工程的含义：通过细胞、组织、器官培养以及细胞融合等，达到改良品种、快速繁殖或生产生物产品的一种技术。

研究内容：

细胞工程基本技术

细胞、组织、器官培养

原生质体培养

细胞融合及培养第3页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.1植物细胞工程的基本原理

4.1.1植物细胞的全能性

1934年，White首次定义为:每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。

70年代，扩大了以上定义范围，为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。

80年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。

第4页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。

细胞全能性的绝对性与相对性:

不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体；动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。第5页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三第6页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:

营养生长中心>形成层>薄壁细胞>厚壁细胞(木质化细胞)>特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织(基本组织)>厚角组织>输导组织>厚壁组织。第7页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

脱分化：具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程称为脱分化。（如根、茎、叶）

再分化：是指离体培养物可以由脱分化状态再度分化。包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。第8页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三第9页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.1.2植物激素的调控作用

激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响相关基因的表达从而调控细胞分化。但应该注意到，在植物中细胞种类的不同或同一种细胞不同的发育状态，均会影响该种细胞对激素的反应，即靶细胞反应差异，所以试图寻找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困难的。第10页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2植物细胞和组织培养所需的营养和环境条件

4.2.1培养基的组成和配制

4.2.2影响植物组织培养的环境条件第11页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.1培养基的组成和配制4.2.1.1培养基的基本成分（1）无机成分培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。第12页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

大量元素

培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供。微量元素

微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl

其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。第13页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（2）碳源

糖在培养基的作用：

①为细胞提供合成新物质的碳骨架

②为细胞的呼吸代谢提供底物和能量

③维持渗透压

蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。第14页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（3）维生素类维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。第15页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（4）植物生长物质植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。第16页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸类：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。第17页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂。

2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力。

3、形成愈伤组织，促进生根。

4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。第18页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三细胞分裂素是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。功能：1、促进细胞的分裂和分化2、诱导芽的分化3、促进侧芽的萌发和生长4、抑制衰老第19页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三控制植物细胞分化：分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件。比例高时——产生芽,比例低时——产生根。第20页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三赤霉素（GA3）生理作用：

1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效。

2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。

3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。

4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。

注：不耐热，应采用过滤灭菌加入。第21页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三脱落酸（ABA）生理作用：

1、抑制蛋白质的合成。

2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用。

3、诱导休眠、促进衰老和脱落。第22页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。

生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L第23页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（5）有机附加物

①肌醇（环己六醇）

肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成

②天然有机物

一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。

③AA类物质

绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。第24页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.1.2培养基的种类和配制MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。第25页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。KM—8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。第26页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（1）培养基的种类（根据无机盐的浓度）：

①高无机盐含量培养基

钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。第27页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三②高硝态氮培养基

硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。第28页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三③中等无机盐含量培养基

大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。第29页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三④低无机盐含量培养基

大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。第30页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。第31页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。第32页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三培养基的筛选：

1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养基。

2、植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。

3、有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。第33页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（2）培养基的配制

配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度大若干倍的母液。当配制培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液稀释即可。母液应保存在冰箱中备用，保存时间不可过长，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能使用。

贮备液（母液）的配制：

a、方便

b、准确（有些成分量太小）第34页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三培养基的配制步骤：1、计量

根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度（mg/L）。

2、移液

取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意（1）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。

（2）量取母液时，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。第35页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三3、称取琼脂蔗糖备用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。

大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。第36页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三5、混合

将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。

6、调pH

用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。第37页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三7、分装

溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。

9、培养基的灭菌第38页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2影响植物组织培养的环境条件

培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织。第39页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.1温度培养都是在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在26-28℃。冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培养温度控制在18-22℃或<25℃。第40页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.2光照的影响培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光周期等方面：光周期：黑暗与光照交替的时间光量：光照强度光质：光的波长第41页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三1、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应

例1：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的生长，同经光照培养一样的多。

例2：短日照敏感的葡萄品种，它的茎切段，仅在短日照条件下才能分化成根。

例3：对日照不敏感的葡萄品种，可在任何光周期下分化成根。

结论：光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定。第42页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三离体培养中光周期的调节

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照。

器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。第43页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三2、光量的影响

光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。

离体培养条件下常用的光量，一般为1000-4000lx（勒克斯）。离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照强度的高低直接影响器官分化的频率。

高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根。第44页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三3、光质的影响

光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，2周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。

离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为419-467nm。

对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受600-680nm所刺激。第45页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.3湿度组织培养中湿度的影响有两个方面：

一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。

一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求70～80%。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。第46页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.4pH值不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。一般来说pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值（约0.2-0.3个pH值）因此在配制时常提高pH值0.2-0.3单位。第47页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.5渗透压培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。渗透压调节物质

培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。糖除了作为渗透压调节物质外，还是培养基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作为调节物质。第48页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.2.2.6气体影响氧气是培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。第49页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.3外植体的选择及消毒

4.3.1外植体的选择

4.3.2植物材料的消毒第50页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.3.1外植体的选择

外植体是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。它是植物离体培养的基本材料。总体原则：

a.根据培养需求选择植物部位。

b.多年生植物注意树龄和季节。

c.在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体。

第51页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.3.1.1取材部位的选择外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。1974年TranThanhVan等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。第52页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.3.1.2器官的发育阶段和生理状态外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不同的植物类型则有较大差异。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好的结果。第53页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.3.1.3外植体的大小接种外植体的大小和形状并不需要严格限制，但是不能太小，小到肉眼能见到的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。外植体细胞的数目多，能获得愈伤组织的机会也多。研究表明：外植体的损伤表面积会分泌出某些物质，这些物质具有促进愈伤组织形成的能力，因此表面积越大，产生这类物质的数量也就越多，愈伤组织得率也越高。如果可取的组织不多，则外植体的体积应该尽可能小一些，从而得到较大数量的外植体。如利用茎尖培养，脱毒快繁，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。第54页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三

4.3.2植物材料的消毒

大田或温室植物材料，都带有大量的的细菌和真菌，一旦与培养基接触，这些微生物就迅速繁殖