实验：分离以尿素为氮源的微生物

实验2分离以尿素为氮源的微生物思考：采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？一.实验原理

尿素NH3

中性碱性

酚红颜色：

(酸性)黄色

红色(变色范围

pH6.4-8.2)二.实验目的使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶)通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应)以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。三.实验步骤２.倒平板３.制备一定浓度梯度的细菌悬液１g土壤＋９９ml无菌水，振荡，为１０-2稀释液，依次制备１０-3、１０-4、１０-5的土壤稀释液。４.稀释涂布分离法分离细菌１.制备无菌的全营养ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基５.培养观察（倒置，37℃24-48h）（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）1、配制培养基尿素培养基葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g

琼脂糖0.5g

酚红0.25g

尿素

10mlLB培养基蛋白胨：0.25g酵母提取液：0.12gNaCl：0.25g

琼脂糖：0.5g

对照组选择培养基实验组为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？

琼脂和琼脂糖琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培养基固化；③不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。思考？选择冒培养需基加入牌青霉荣素的歪培养梢基:分离框酵母鼓菌、轿霉菌窃等真俘菌加入扭高浓葛度食重盐的随培养去基:分离慨金黄衣色葡惯萄球国菌不加枣氮源兼的无择氮培弱养基:分离倒固氮芳菌不加赛含碳明有机森物的嗽无碳左培养左基:分离庙自养饮型微浴生物加入锹青霉写素等全抗生略素的磨培养捕基:分离蜻导入组了目奸的基谨因的司受体份细胞——添加房诚或缺碗少某系种化锅学成缸分用做于菌们种的拿分离2、倒桐平板制备恒空白镰平板：取2个三佣角瓶抄，分射别装塑入已纷灭菌漠的全饱营养LB固体生培养绑基和尿素挺固体浑培养坛基，放贞在超打净工拢作台营上，俗冷却狗至60感℃左右牛时，旅在酒窜精灯病旁把坐上述鼻两种闭培养拦基分纸别倒笑至培圆养皿毒中，柏轻轻越摇匀龟，平蔬放至占凝固祥。2、倒茅平板在无当菌条恼件下滨，在涨将1g土样晒加到忍装有99mL无菌吉水的诉三角食瓶中例，振尺荡10虾mi推n，即胖成10-2土壤辉稀释有液，晌并依切次制样备出10-3～10-5稀释此液。数例如皱，若券想制借备10-3的稀亮释液到，可耽取0.袄5mL10-2的稀粥释液主。取巨样时件，尽量黑只取坟悬液，倒谷入有4.胃5mL无菌疲水的昼有盖衫试管舟中，茫摇匀叔，放惨在试尘管架情上。3、制备扶细菌辆悬液4、涂布亩分离涂布挖法分陈离细尼菌：圣在无澡菌条认件下耻，分抖别取0.横1mL的稀残释度哑为10-3、10-4和10-5的土觉壤稀啦释液寄（细哨菌悬灶液）这，摊分别膨加到竿装有尿全营删养LB培养顽基和浪尿素测培养韵基的各培养牧皿（筛空白趋平板似）中俊；再将保存园在70辅%酒精怎中的园玻璃夕刮刀种放在茎酒精梨灯火船焰上嘉，待蒙刮刀这上火诸焰熄热灭后串，在酒腾精灯责火焰庙旁打川开培管养皿凯，将袖前面刻已加绑入的粥土壤范稀释旦液（奏细菌仪悬液晃）均臭匀涂糟布到它整个盖平面虑上。接种取0.嫂1m闹l菌悬毒液涂布渣分离按浓易度捆具成一姓摞5、37场℃恒温邮培养哭箱瞎倒置顽培养四1、为转什么跑要用功琼脂仗糖代而替琼矛脂配博置固痕体培津养基因为添琼脂染是未被眠纯化的混堪合物猜，内含一定竖量的含氮筑化合遥物。如顾果用伶琼脂踩固化宋培养浇基，碎会为琴细菌雨提供议一定零量的区非尿障素类江氮源异，这椒样会挺在尿庭素固辛体培西养上千产生信大量写以非倒尿素辈为氮挺源的樱细菌慌，不耐利于臭以尿摄素为啄氮源凝的细膨菌的肌筛选犯，故假用纯阔化的如琼脂慰糖而哨不用俗琼脂蚕做固寸化剂思考妇题：2、有产脲酶误的细舰菌在秀生态签稳态兼上起榴什么鼻作用如果袄土壤粱中有烈许多动尿素呀，在崖自然荐界较惜高温扭度下滥就会丝式被水彩解，达水解控后的NH3会使叮土壤粪变成县碱性森，NH3与其牛他阴唇离子轰物质锄如SO42－、CO32－、NO3－等形忍成化伤合物叹，则风会使喷土壤税板结削。有脲里酶的白细菌互使植录物废短弃物瓶和动猪物尸凉体降绞解，约并利反用了列所形什成的烂氨，尤有利财于自厌然界户中氮的僵循环。3、有妈脲酶返的细竟菌菌丘落周请围为洗什么控有着术色的钢环带旋出现夜。细菌用向胞锄外分毒泌脲维酶，他使培喂养基郊中尿理素水次解，偷水解贤后产鸦生氨寺，氨雨为碱亿性，铜酚红医在酸召性环活境里违呈黄龟色，午碱性牙里呈母红色铲。培鲁养基口中酸员碱指资示剂看产生奋颜色舌变化眠（变姿红）张，标改志着局存在耐脲酶诉水解晚尿素条的作把用，贤从而矮证明添这一夫菌株顶以尿兔素为普氮源纸。4、与颈全营决养培馅养基略上的川菌落身数比参较，播为什历么尿喷素培汗养基终上只昂有少棕数菌慕落因为院全营熔养培轻养基理中的爱氮源资是蛋豪