实验三-酶学实验

实验三酶学实验实验内容实验十四pH值对酶促反应速度的影响实验十五温度对酶促反应速度的影响实验十六底物浓度对酶促反应速度的影响实验十七抑制剂对酶促反应速度的影响实验十四pH值对酶促反应速度的影响【实验目的】1．掌握pH对酶促反应速度的影响。2．了解测定酶活性的原理、学会操作。【实验原理】酶的本质是蛋白质，构象及电荷状态影响酶与底物的结合催化，因此酶活性会受溶液pH的影响。底物或辅基的解离程度受溶液pH的影响。酶的最适pH值：一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，而且在某一pH值时，酶的催化活性达最大值。AKP（碱性磷酸酶）活性测定：磷酸苯二钠法铁氰化钾【实验试剂】（1）甘氨酸缓冲液：多种pH值（2）酶液（3）0.04mol/L基质液（4）0.3%4-氨基安替比林（5）0.5%铁氰化钾溶液【实验方法】1.取小试管6支，编号，按下表操作：管号

123456甘氨酸缓冲液pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.01.01.01.01.01.0蒸馏水1.00.04mol/L基质液1.01.01.01.01.01.0

置37℃水浴保温15min酶液1.01.01.01.01.0

2．立即混匀，置于37℃水浴中，保温15min。3．保温结束，各管分别加0.2mol/lNaOH1ml终止反应。4．各管分别加入1.0ml0.3%4-氨基安替比林和2.0ml0.5%铁氰化钾溶液，充分混匀，放置10min，肉眼观察，比较各管颜色之深浅，用+→++++表示，观察哪一pH值下酶活性最强。实验十五温度对酶促反应速度的影响

【实验目的】1．掌握温度对酶促反应速度的影响。2．了解温度对酶促反应速度影响的测定方法。【实验培原理】温度田升高号对酶松促反瓶应产占生两舰种相状反的尺效应萍：反应遭速度雄随温育度升赔高而推加快盯，酶蛋医白变面性失晨活的倾速度商随温激度升朽高迅仅速增酬加，旬从而去使反世应速夏度减昂慢。酶的忙最适撕温度但：酶促者反应湿速度仓最快旦时的哈环境渴温度优。实验小检测徐对象：碱卵性磷昆酸酶（1）0.绿1m茧ol黑/L叠p镜H1已0碳酸贞缓冲草液（2）0.垂04师mo到l/地L基质枪液（3）酶形液（4）0.往3%封4域-氨基朋安替迎比林（5）0.潜5%铁氰但化钾品溶液【实验值试剂】【实验旷方法】1.取小道试管5支，帅编号侦，按须下表元操作加入遵酶液幻玉后，立即岔混匀，再定置各密温度弄下保夺温。

管号

123450.1mol/LpH10碳酸缓冲液1.01.01.01.01.00.04mol/L基质液1.01.01.01.01.0预温5min冰浴室温37℃75℃室温血清或酶液0.10.10.10.1-保温15min冰浴室温37℃75℃室温2．保习温结稿束后元，立即加入1贿ml什0务.2嚷m原ol抢/lNa益OH终止析反应内。3．各难管再兰分别烫加入0.晶3%带4侦-氨基拦安替拘比林1.叙0滚ml及0.朴5%铁氰搏化钾兔溶液2.雁0乞ml，充认分混同匀，窑室温准下放木置10创m涛in，4．肉制眼观语察，甲比较乓各管掠颜色搭之深禁浅，政用+就→掉++赠++表示秤，观绍察哪吸一温舅度下弄酶活交性最关强。底物津浓度蓄对酶穴促反么应速膝度的熔影响【实验邀目的】掌握冲有关值酶促源反应蜘动力沈学的酱基本磁知识铁。【实验誉原理】在温标度、pH及酶钥浓度肺恒定役的条墙件下罢，底具物浓直度对烧酶的担催化瓜作用岩有很做大的仙影响困。在腰一般匙情况物下，仍当底纷物浓炼度很比低时碗，酶角促反勺应的笨速度房诚（V）随锦底物瓜浓度〔S汽〕的增昨加而毒迅速抱加快常，但眼当底务物浓覆度继展续增箱加时蜓，反沫应速吗度的贩增加骨率就愁比较誉小，则当底隆物浓挽度增刮加到笋某种似程度厦时，肝反应螺速度芦达到睁一个撑极限鸽值（勾最大凉速度Vm）VmaxV[S]KmVmax/2ＶVmax[S]Km+[S]＝──【实验启内容杂与方碧法】1.取试退管6支，豆编号弓，按克表操缝作试剂（ml）1234560.04mol/L基质液0.10.20.30.40.8—0.1mol/LpH10碳酸缓冲液0.70.70.70.70.70.7蒸馏水1.11.00.90.80.41.237℃水浴保温5min

酶液0.10.10.10.10.10.12.加酶耕液后圆，各管炭立即脏混匀，记绒录时雨间，评各管膨在37垂℃水浴庆中保浪温15义mi满n，保翠温结漠束，立即近加入0.爹2m滨ol悲/LNa赏OH1.理0m纱L以终图止反立应。3．各闸管中还分别陈加入0.荷3%亭4栗-氨基骑安替硬比林1.谱0m羽L，0.典5%铁氰徒化钾2.天0m特L，充分蜘混匀，放清置10叹mi引n，以成空白谨管为书对照陷，于51膝0n毒m波长骨处比淡色。抑制欠剂对导酶促肃反应针速度丑的影含响【实验农目的】掌握陪抑制还剂对薄酶的盘活性光的影包响及掏检测声方法串。【实验腰原理】凡能个降低喷酶的秋活性之，甚毙至使摄酶完涉全丧困失活雄性的徒物质塔，称没为酶堤的抑父制剂勇。竞争查性抑轿制剂拳的作碧用特太点是衰使酶韵的Km值增素大，半但不佣影响立酶促莫反应扮的最厘大速缎度Vm。非竞蝇争性佩抑制晴剂的泻作用锦特点派是酶惠的Km值不双变，胳但酶烂促反凶应的德最大幼速度Vm降低约。【实验素内容浑与方丸法】1．取帐试管6支，栏编号长，按杯表2-金12操作试剂（ml）1234560.04mol/L基质液0.10.20.30.40.8—0.04mol/L磷酸氢二钠0.10.10.10.10.10.10.1mol/LpH10碳酸缓冲液0.70.70.70.70.70.7蒸馏水1.11.00.90.80.41.237℃水浴保温5min

酶液0.10.10.10.10.10.12．加斥酶液阅后各瓦管立即所混匀，记谜录时昌间，臣在37菠℃水浴唯中保梳温15性mi客n后，立即钞加入0.态2m霜ol庄/LNa涂OH1.阶0m棒L以终薄止反摊应。3．各服管中秒分别足加入0.扑3%丽4崭-氨基胆安替犯比林1.卫0m卧L，0.洗5%铁氰帽化钾论溶液2.容0m估L，充分窄混匀，室虫温放精置10检mi换n。以锁空白济管为歪对照解，于51罗0n势m波长身处比育色。【注意炮问题】底物删溶液书中不架应有承游离察