探讨聚合酶链式反应PCR

探讨聚合酶链式反应PCR一、PCR历史PCR的最早设想：核酸研究已有100多年的历史，本世纪6070年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现：1985PE-CetusKaryMullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起足够重视。

1987年KaryMullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。PCR的突破：1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR使PCR自动化成为可能。PCR的确认：1993年度，KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。20世纪80年代末，PCR技术成为遗传和分子分析的重要技术。多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。二、PCR的特点及应用：PCR操作简便、省时；灵敏度高；对原始材料的质和量要求低；特异性强。因此，广泛应用于许多领域。基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；遗传病的产前诊断；致病病原体的检测；癌基因的检测和诊断；DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；动、植物检疫；在转基因动植物中检查植入基因的存在。二、PCR反应系统的组成PCR反应系统的组成主要包括：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。1、引物：要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段。两引物间距离决定扩增片段的长度。两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键。引物设计十分重要。PrimerIPrimerIIAmplifiedtargetfragment（1）、引物的设计：长度最高不超过30个核苷酸，最佳长度为15～25个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primerdimer）。(G+C）%含量：引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体，45%-55%为宜。G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。5、Tm

值高于55C

。Tm允许的范围内选择较高的退火温度可大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR的特异性。6、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。7、引物扩增跨度以300-500碱基为宜。8、引物的特定性，引物应与核苷酸序列数据库的其它序列物有明显同源性。（2）、引物的浓度：

引物在PCR反应中的浓度一般在～1μM（或10～100pmol）之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。（3）引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般实验中退火温度Ta(annealingtemperature)比扩增引物的融解温度Tm(meltingtemperature)低5℃，可按公式进行粗略计算：Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如）,退火反应数秒即可完成。（4）、引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min。2、寡核苷酸（dNTP）（1）、dNTP的质量与浓度

dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTrisHCL的缓冲液将其PH调节到～，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。（2）、dNTP与PCR反应在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性。使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入。高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。

PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量，或过早终止反应。TaqDNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。3、TaqDNA聚合酶:Taq酶的活性单位定义（Takara公司）：用活性化的大马哈鱼DNA作为模板/引物，在740C、30分钟内，摄入10nM的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为一个活性单位。（1）、模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。4、模板(靶基因)核酸（2）、模板的用量虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的DNA。（3）、模板变性温度它决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力。加入TaqDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。（4）、模板核酸的量与纯度它PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；用乙醇或异丙醇沉淀核酸。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。5、Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为～为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。6、PCR缓冲液:用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris–HCl缓冲液（）和1.5mMMgCl。在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。7、PCR循环次数常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。三、PCR扩增过程

在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。(1)变性阶段加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链；(2)退火阶段降低溶液温度，使合成引物在低温（35－65℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；(3)延伸阶段溶液反应温度升至中温(72℃)，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。PCR

原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等TaKaRaTaq(5U/l)10XPCRBuffer(Mg2+Plus)dNTPMixture(each10mMor2.5mM)模板(10ng，实验1自提质粒)引物（Primer1and2,10M)四、实验仪器及材料10xPCRBuffer：(100mMTris-HCl,pH8.3,500mMKCl,15mMMgCl2)InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10Primer1(FrompCMV-Myc827-847):5’TTCC

AAGCTTCACCATGGCATCAATGCAGAAGC保护性碱基

HindIIIMyctagTm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×12＋2×11＝700C.Primer2(FromT101249-1270):5’TCGC

GGATCCAGTGGCATCAGAGACTTGCTAATC保护性碱基BamHITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C.PCRMixture:TemplateDNA:1l(10ng)Primer1:1l(10M)Primer2:1l(10M)dNTPs:4mM)TaqDNApolymerase:0.5l(5U/l)10×buffer（Mg+）:5ll

50lPCR条件：

94℃变性5min后开始以下循环

94℃变性反应45sec；

65℃退火反应45sec；

72℃延伸反应1min；进行30个循环；最后72℃反应7min；

4℃冷却恒定。五、PCR产物分析取3-5lPCR产物，采用％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。PCR结果：DNAMarkerPCRproduct六、PCR污染与对策（一）、污染原因

1、标本间交叉污染:收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.

2、PCR试剂的污染:

主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

3、PCR扩增产物污染（1）、PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.（2）、气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.

4、实验室中克隆质粒的污染因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.（二）、防止污染的方法

1、合理分隔实验室:最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区.实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.

2、吸样枪:由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.

3、预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.

4、防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.

5、设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.

6、减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.

7、选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出。

七、荧光定量PCR

荧光定量PCR（也称TaqManPCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。（一）、荧光定量PCR技术定义是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。二、荧光定量PCR原理1.

Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（域值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。故必须确定Ct值。

2.

荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个