小鼠IL12基因转染对人卵巢癌Skov3细胞的生长及细胞因子的表达

小鼠IL12基因转染对人卵巢癌Skov3细胞的生长及细胞因子的表达【摘要】目的：观察含小鼠IL12全长基因的质粒转染到Skov3人卵巢癌细胞中，在脾细胞存在的情况下对肿瘤细胞的影响及相关细胞因子的表达.方法：脂质体转染技术将基因转染至Skov3人卵巢癌细胞中，ELISA方法检测IL12及INFγ的表达，MTT方法检测对Skov3卵巢癌细胞增殖的影响.结果：转染后48h检测到IL12的高表达，约(473±38)ng/L；而未转染组约13~17ng/L，两者比较差异有统计学意义.在脾细胞作用下产生INFγ，以作用后24h表达量高，约(173±18)ng/L，较未转染组高，比较有统计学意义(P＜).转染后癌细胞免疫组化可见IL12表达，在脾细胞的作用下，IL12对Skov3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用(P＜).结论：可以将IL12基因转染至Skov3人卵巢癌细胞中并表达IL12，脾细胞检测其活性并有相应的细胞因子产生，对Skov3细胞有抑制其增殖作用，从而杀伤卵巢癌细胞，具有抗肿瘤作用.

【关键词】白细胞介素12；卵巢肿瘤；基因治疗

0引言

肿瘤生物学治疗的许多细胞因子中IL12是最有效的［1］.它具有明显的抗原发和转移瘤的作用，且毒性远比IL2低，成为广大学者研究的热点之一.卵巢恶性肿瘤在盆腔内生长，易于转移而广泛播散，复发率、转移率均较高.杨红等［2］将β葡萄糖醛酸苷酶基因转入卵巢癌细胞以探索卵巢癌临床基因治疗.我们将含有小鼠IL12全长基因的质粒转染至Skov3人卵巢癌细胞中，观察其表达情况及其相关细胞因子的表达，评价其抗肿瘤效果，探讨临床应用的可行性.

1材料和方法

材料人卵巢浆液性乳头状囊腺癌Skov3细胞株用含100mL/L小牛血清的RPMI1640(Gibco公司产品)培养液，在37℃，50mL/LCO2条件下培养，隔天换液，细胞长满单层后用g/L胰蛋白酶消化传代.含有全长小鼠IL12质粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大肠杆菌；成年KM小鼠2只，购于黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心；脂质体转染试剂盒Roche公司产品.

方法将已经转化质粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大肠杆菌菌株加入LB培养基5mL中，置于37℃摇床中24h，传代过夜，见培养基较浑浊后进行提取，-20℃保存并取25μL质粒溶液加入蒸馏水1mL中，分光光度计260，280nm下观察A值，得到质粒的浓度和纯度.DNA浓度公式：c(mg/L)=A260nm/;DNA纯度公式：A260nm/A280nm.将Skov3细胞制成单细胞悬液，以1×106接种于6孔板中.贴壁后，用不含血清和抗生素的RPMI1640培养液洗板3次，将含有质粒和脂质体的混合液轻轻混匀放置10min后将混合液加入6孔板中，设无小鼠IL12基因的空白质粒为对照.置37℃,50mL/LCO2孵箱中培养，6h后更换含100mL/L胎牛血清的培养液，于孵箱中继续培养进行转染.收获不同时间的培养上清按小鼠IL12ELISA试剂盒说明建立标准曲线，于转染后24，48，60h检测上清IL12表达水平.以未转染的Skov3为对照.

取成年KM小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，加RPMI1640培养液3mL混匀培养，稀释10倍后细胞记数器记数：C=(A+B+C+D)/4×10×104.吸取转染后48h的上清，加入脾细胞悬液中，培养0，24，48h，分别检测INFγ表达；收集转染后的Skov3卵巢癌细胞，将脾细胞悬液加入其中，共同培养24，48h后，收集上清，检测INFγ表达.以未转染的Skov3A值为对照MTT法检测Skov3卵巢癌细胞抑制率=［/A对照组］×100%

统计学处理：全部数据经统计软件SPSS处理，组间比较用方差分析，为有统计学意义.

2结果

质粒浓度=μg/L；DNA纯度：A260nm/A280nm=转染后Skov3细胞光镜下形态未见明显变化.

小鼠IL12的表达转染后24，48及60hIL12表达水平分别为75±9，473±38，522±32；而未转染组分别为13±4，16±4，17±6.转染后组IL12表达水平较未转染组明显增高，48和60h的表达有统计学差异.

γ的表达转染后48h上清与脾细胞悬液共同培养作用0，24，48h，ELISA方法检测得INFγ的表达水平分别为：±，±，±，其中共同作用24hINFγ表达水平较高；转染48h后Skov3卵巢癌细胞中加入脾细胞悬液，共同培养24，48h后，收集上清检测INFγ的表达，测得INFγ表达水平分别为：±，±转染后的Skov3卵巢癌细胞与脾细胞共同作用24h后可测得高水平INFγ的表达.提示转染后Skov3的卵巢癌细胞持续分泌的IL12能促进效应细胞产生持续高水平的INFγ表达.脾细胞与转染后Skov3的卵巢癌细胞共同作用24h后，A490nm为±，与未转染的Skov3卵巢癌细胞A490nm±比较有差异；与未转染的Skov3+S作用后的A490nm值±比较差异有统计学意义.而TSkov3，Skov3，Skov3+S，Skov3组比较差异无统计学意义.转染后的Skov3卵巢癌细胞与脾细胞共同作用24h后，对卵巢癌的抑制率为%，表明在脾细胞存在共同作用下小鼠IL12对Skov3卵巢癌细胞的增殖有明显的抑制作用.

3讨论

细胞因子疗法是肿瘤生物疗法之一.Yamazaki等［3］将含有鼠IL12基因的质粒转导到BCG中，发现能够检测到IL12,INFγ的高表达并且增加了BCG的肿瘤杀伤效应.王克敏等［4］将含有小鼠IL12基因与MHCI基因的质粒采用脂质体转染法转染到肝癌细胞株中，用ELISA方法测得上清中小鼠IL12表达为48ng/L.我们以脂质体转染技术将含有鼠全长IL12基因的质粒转染到Skov3卵巢癌细胞中，脂质体作为治疗基因载体较病毒载体的优点是安全、操作简单、转染成功率较高,但转染率较低，因此IL12表达水平不是特别高，较相关文献报道水平低.

INFγ具有较强的抗肿瘤作用［5-6］,能够抑制肿瘤生长，并能抑制机制转移蛋白酶，从而抑制肿瘤转移.IL12通过诱导INFγ的产生，抑制肿瘤.

本实验结果显示在部分效应细胞脾细胞的存在下，小鼠IL12对卵巢癌细胞的抑制杀伤作用，并检测了相应的效应因子的表达，初步探讨了其在卵巢癌细胞中的抗肿瘤作用.由于细胞因子间相互作用是一个复杂的网络，本研究中的细胞因子种类有限，不能全面解释IL12的抗卵巢癌作用，尚需继续完善.

【参考文献】

［1］GorelikE,EdwardsRP,FengX,etal.IL12receptormediatedupregulationofFasLinhumanovariancarcinomacells［J］.IntJCancer,2004,112(4):620-627.

［2］杨红，辛晓燕，秦卫军.β葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性［J］.第四军医大学学报,2003,24:1575-1577.

［3］YamazakiM,ZhangR,StrausFH,etal.Effectivegenetherapyformedullarythyroidcarcinomausingrecombinantadenovirusinducingtumorspecificexpressionofinterleukin12［J］.GeneTher,2002,9(1):64-74.

［4］王克敏，夏爱娣，陈诗书.质脂体介导Mil12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠试验性肝癌的治疗作用［J］.癌症,2002,21:1041-1046.

［5］ComesA,CarloED,MusianiP,etal.IFNγindependentsynergisticeffectsofIL12andIL15induceantitumorimmuneresponsesinsyngeneicmice［J］.EurJImmunol，2002,32(7):1914-1923.

［6］YunCH,LundgrenA,AzemJ,etal.Na