生物药剂学与药物动力学实验

10生物药剂学与药物动力学试验名目一、根本学问与根本技能二、验证性试验试验一磺胺嘧啶在体小肠吸取试验试验二磺胺类药物的组织分布试验试验三血浆蛋白结合率测定试验四尿药法测定核黄素片剂药动学参数试验五卡马西平血药浓度监测试验六苯酰甲硝唑分散片人体生物等效性试验试验七TDXA三、设计性试验试验一血药浓度测定与药动学争论试验二制剂生物利用度试验试验三阿司匹林缓释片体内外相关性试验试验四氨茶碱血药浓度的监测和治疗方案设计试验五重复一点法测定药动学参数四、综合性试验试验一对乙酰氨基酚溶出度测定及溶出参数的计算试验二对乙酰氨基酚血药浓度测定与药物动力学争论试验三阿司匹林肠溶片的血药浓度测定五、附录一、根本学问与根本技能生物药剂学是争论药物及其剂型在体内的吸取、分布、代谢、排泄过程，说明药物的剂型因素，机体生物因素和药物疗效之间相互关系的一门学科；药物动力学是应用动力学原理与数学处理方法，定量描述药物在体内动态变化规律的学科。生物药剂学与药物动力学是药学专业的一门主要专业课程。使学生在把握生物药剂学和药物动力学的根本概念、根本理论和争论方法根底上，能初步应用有关学问正确评价药物制剂质量，设计合理的剂型、处方及生产工艺，并为临床合理用药供给科学依据，也能应用药物动力学的原理进展药物制剂生物等效性评价、给药方案设计及临床药物治疗方案的个体化等。试验课是生物药剂学与药物动力学课程中必不行少的重要实践环节。通过实践教学，学习生物药剂学与药物动力学试验的设计及数据的处理方法，生疏生物样品处理与检测的方法，能进展临床药代动力学试验的设计及数据的处理，把握试验方法在临床合理用药方案设计中的应用，把握专业试验技能，培育学生独立思考和独立工作力量以及科学的工作态度和习惯。生物药剂学与药物动力学的试验对象常为动物或人，通常通过赐予受试对象药物或制剂后，检测不同时间生物样品中药物与代谢物的浓度变化来了解药物在体内吸取、分布、代谢与排泄规律。因此，生物样品的处理与分析是生物药剂学与药物动力学争论中的重要内容，下面主要就生物样品的前处理、试验方案与数据处理方面的根本学问与技能进展介绍。〔一〕生物样品收集与处理生物样品的收集血样对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能供给更此最常用的生物样品是血浆〔plasma)和血清〔serum)，测定血中药物浓度通常也是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度严密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内〔靶器官〕的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的牢靠指标。但临床上也有少数药物由于在血细胞中分布较多，需要检测全血中的药物浓度如环孢素A、雷帕霉素等。1〕取样：动物试验时，依据动物不同，取样部位各异，如家兔一般可从耳缘静脉屡次采血；大鼠可通过眼眶静脉丛或断尾取血，也可由颈动脉插管取血；犬一般从四肢静脉取血；对于病人或安康受试者，通常采集上肢静脉血。采集血样后，应准时分别血浆或血清，并马上进展分析。如不能马上测定时，应完全密塞后冷冻〔-20℃〕保存。2〕制备：血浆的制备将实行的血液置含有抗凝剂〔EDTA-钠等〕的试管中，混合后，离心，分别血细胞，上清液即为血浆。肝素最常使用的抗凝剂，常用其钠盐、钾盐，能阻挡凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.1～0.2mg的肝素，加入血样后马上轻轻振摇，但勿太猛烈，以免导致溶血。试验室肝素化管的制备方法常应用肝素钠注射液2ml加蒸馏水至10ml，摇匀后倒入干净采血管中润过管壁后倒出，烘干即可使用。血清的制备血清是在血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液分散而析出的澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的30％～50％。在室温高时，血凝过程进展得很快，宜在血凝后半小时内分别血清。当室温较低时，血凝过程慢，可将血液置37℃温度下加速血清析出。唾液唾液的采集一般在漱口后15min收集，应尽可能在刺激少的安静状态下进展。采集后马上测量其除去泡沫局部的体积。经离心分别，取上清液作为药物浓度测定的样品。唾液中含有粘蛋白，为阻挡粘蛋白的生成，应将唾液在4℃以下保存，解冻混匀后再用，否则易产生误差。(3)尿液尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，也便利，但尿液浓度通常变化较大，应测定肯定时间内排入尿中药物的总量，这就需要测定在规定时间内的尿液体积及尿药浓度。测定尿中药物的总量时，收集肯定时间内〔如2h或4h等〕排泄的尿液，并记录其体积，取其一局部测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄量，计算累积排泄尿量。采集的尿液时，需用量筒准确地测量储尿量，并做好记录。生物样本的前处理在测定生物样品中药物及其代谢物时，样品的前处理格外重要。除了少数将体液经简洁处理后进展直接测定外，一般要在测定之前进展样品的前处理，即进展分别、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进展化学衍生化，从而为测定制造良好的条件。生物样品进展前处理的目的主要在于：①药物进入体内后，经吸取、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型〔原型〕药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形要分别后测定药物及代谢物；②生物样品的介质组成比较简单。如在血清中既含有高分子的蛋白质Na＋、K＋、X-等无机化合物。其中影响最大的是蛋白质，假设用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严峻影响分别效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必需进展除蛋白等前处理。样品前处理一般包括以下内容：样品匀化对于生物样品，应在测定前混合均匀，以免造成测定误差。可置涡混仪上混匀，血浆样品往复振摇亦可到达匀化目的。对粪便、肌肉和组织等固体样品也存在匀化问题。对含有不溶性组分的样品(例如组织和粪便)，须将样品进展匀浆处理，以保证样品的均匀性。同时还应留意取样的代表性问题。去蛋白处理生物样品如血浆、血清等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物的测定，必需先将与蛋白结合的药物游离后再作进一步处理。①参加与水相混溶的有机溶剂参加水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质分散，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比通常为1:〔1～3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，承受超速离心机〔10000r/min)离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。②参加中性盐中性盐能置换与蛋白质水合的水，从而使蛋白质发生脱水而析出沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常一起，可提高药物的回收率。③参加强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，参加强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而析出沉淀。常用的强酸有：三氯醋酸、高氯酸等。但在酸性下易降解的药物不宜用本法去除蛋白。④参加含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04、Na2W04、ZnS04等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分别后得上清液。被测组分的提取生物样品中被测组分常需提取后才能进展色谱分析，这一步骤包含了样品的净化与浓缩。提取方法和提取条件的选择是分析方法争论的重要内容之一，它与分析方法的选择性、周密度和准确度严密相关。①液-液提取液-液提取是经典的提取方法之一，它基于被测组分在不相混溶两种溶剂中安排不同。在提取过程中，水相pH是重要参数：一般弱酸性药物可参加肯定量的酸，弱碱性药物可参加肯定量的碱，使药物以分子状态存在，有利于有机溶剂的提取效果。有时可参加一些强离子的无机盐(如氯化钠)，利用盐析作用，能促进组分进入有机相。通过选择不同的有机溶剂可提高选择性。一般可选用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲基叔丁基醚等有机溶剂及其不同比例的混合物进展提取。液-液提取用于水为基质的样品中非极性或弱极性组分的提取，液－液提取后有机相可用氮气或空气吹干，残渣可用与色谱方法相适应的溶剂或流淌相溶解后进样。液-液提取有时会发生乳化现象以及被测组分损失。为了防止乳化，可应用较大体积的有机溶剂，避开猛烈振摇或参加适当的试剂转变其外表张力而破乳，假设已发生严峻的乳化现象，可将试管置于冰箱中冷冻破乳。②固相分别固相分别又称为固相提取柱法，其常用的柱填料有吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂、键合硅胶等。固相分别有两种实现样品纯化的途径。一种是保存杂质，待测组分不被保存而自然流出或者被洗脱。更为常用的一种途径是先使待测物完全保存在柱上，使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出，然后以小体积溶剂洗脱待测物。键合硅胶固相提取的一般操作步骤如下：①以适当强溶剂潮湿固相提取填料使其溶剂化；②以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤填料，使其到达良好的分别状态；③将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中的样品加到固相提取柱上；④以强度适当的弱溶剂，如含有少量甲醇的水或缓冲溶液，洗涤、除去基质或干扰组分；⑤用强度较高的溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液，直接或适当浓缩后进展色谱分析。〔二〕试验设计药物动力学争论分为临床前药物动力学争论和临床药物动力学争论。临床前药动学争论是通过动物体内、体外和人体外的争论方法，提醒药物在体内的动态变化规律，获得药物的根本药物动力学参数，说明药物的吸取、分布、代谢和排泄的过程和特点。临床药物动力学争论旨在说明药物或制剂在人体内的吸取、分布、代谢和排泄的动态变化规律。临床前药动学争论在药争论开发的评价过程中起着重要作用。药动学参数是产生、打算或说明药效或毒性大小的根底，可供给药物对靶器官效应的依据；是评价药物制剂特性和质量的重要依据；能为设计和优化临床争论给药方案供给有关参考信息。而通过临床药物动力学争论，可为药临床试验给药方案的拟订供给试验根底，为药上市后的临床药物治疗方案制订供给理论依据。试验药品对进展药物动力学争论的试验药品，其根本要求为：质量稳定且与药效学或毒理学争论所用试验药品全都。试验动物及受试动物数一般承受成年和安康动物。常用的有犬、小鼠、大鼠、家兔和豚鼠等。选择试验动物的根本原则有：首选动物应与药效学或毒理学争论全都；创药应选用两种动物或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物，其他类别药物，可选用一种动物进展试验；口服给药一般不宜选用兔等食草类动物。口服给药一般在给药前应禁食12小时以上，以排解食物对药物吸取的影响。另外在试验中应留意依据具体状况统一给药后禁食时间，以避开由此带来的数据波动及食物的影响。药动学争论至少应了解药物在体内的动力学过程是否有非线性动力学特征。取样时间点安排尽量在糊涂状态下试验，最好从同一动物屡次采样。取样点通常可安排9～112～3Cmax

34～63～5Cmax

1/10～1/20。〔三〕数据处理药物动力学试验争论后依据获得的浓度时间数据，可依据文献报道的隔室模型数或利用隔室模型判别方法自行进展隔室模型确定，然后依据相应的隔室模型求算根本的药动学参数，药时曲线下面积通过梯形面积法求算：AUC0

n1i0

Ci1 2

(t i1 i

Cn。一般药动学试验后需供给的药动学参数有：静注给药的t

AUC1/2

a max

max

1/2控释制剂，应依据屡次给药稳态时完整给药间隔的血药浓度-时间数据，供给稳态时达峰时间t、Css稳态峰浓度

Css、稳态谷浓度

、AUC

、波动度〔DF〕和稳态平均血药浓度C

max等参数，常与被max

min ss ss仿制药或一般制剂比较吸取程度、DF及Css是否有差异，考察试验制剂是否具有缓、控释特征。二、验证性试验试验一磺胺嘧啶在体小肠吸取试验一、试验要求把握大鼠在体肠管泵循环法争论吸取的试验方法。把握药物肠管吸取的机理和计算吸取速度常数(ka)、吸取半衰期(t )的方法。1/2〔a〕二、试验原理药物消化道吸取试验方法可分为体外法(invitro)、在体法(insitu)和体内法(invivo)等。在体法由于不切断血管和神经，药物透过上皮细胞后即被血液运走，能避开胃内容物排出及消化道固有运动等的生理影响，对溶解药物是一种较好的争论吸取的方法。但本法一般只限于溶解状态药物，并有可能将其他因素引起药物浓度的变化误作为吸取。消化道药物吸取的主要方式为被动集中。药物服用后，胃肠液中高浓度的药物向细胞内透过，又以相像的方式集中转运到血液中。这种形式的吸取不消耗能量，其透过速度与膜两侧的浓度差成正比，可用下式表示：dC C CdtdC

DkS GIh P

〔1〕dt

为分子型药物的透过速度；D为药物在膜内的集中系数；k为药物在膜／水溶液中的安排系数；SC为消化道内药物浓度；C为血液中药物浓度；hGI pDk＝P，则P一般药物进入循环系统后马上转运至全身各个部位，故药物在吸取部位循环液中的浓度相当PS低，与胃肠液中药物浓度相比，可无视不计。假设设h k”，式(1)可简化为：dCdt

k”C 〔2〕式(2dX/dt表示透过速度，则：dXdt

kaX 〔3〕上式积分后两边取常用对数，变为：lgXlgX0

k a t 〔4〕2.303以小肠内剩余药量的对数lgX对取样时间t作图，可得一条直线，从直线的斜率可求得吸取速度常数ka，其吸取半衰期t1/2〔a〕为：t1/2(a)

0.693k 〔5〕a在小肠吸取过程中，药物被吸取的同时水分也被吸取，使供试液体积不断削减，所以不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。由于酚红不能被小肠吸取，因此可向供试液中参加肯定量的酚红，在间隔肯定时间测药物浓度的同时，也测定的浓度，由酚红浓度先计算出不同时间供试液的体积，再依据测定药物的浓度，就可以求出不同时间小肠中剩余的药量或被吸取的药量。三、试验步骤1．试剂的配制(1)0.1％NaNO2溶液：称取NaNO20.1g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。(2)0.5％氨基磺酸铵(NH2SO3NH40.5g100ml摇匀。0.10.1g于100m1容量瓶中，加乙醇适量溶解，并用乙醇定容，摇匀。(以上试剂配好后置冰箱中保存。)1mol/L9m1l00ml(5)0.2mol/LNaOH：称取NaOH0.8g加蒸馏水适量溶解后，转移至l00ml容量瓶内定容。(6)生理盐水：称取NaCl0.9g100m1(7)Krebs—Ringer(pH7.4)：称取NaCl7.8g，KCl0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH2PO40.32g，MgCl20.02g1.4g，加蒸馏水适量使成l000ml。(8)1％戊巴比妥钠溶液：称取戊巴比妥钠1g100ml2．供试液与酚红液的配制供试液：周密称取磺胺嘧啶(SD)20mg20mg1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer剂定容，摇匀。20mg1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer3．循环试验的操作5m1/min和2.5m1／min。恒温水浴调整：将水浴温度调整为〔37±0.5〕℃。供试液的预备：取80m1供试液参加循环装置的烧瓶中，见以下图，将烧瓶置恒温水浴中预热至〔37±0.5〕℃。生理盐水的预备：取生理盐水适量，预热至37℃备用。200g40mg／kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，并固定于固定台上。3cm0.3cm肠管洗涤：用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠管内容物。做成回路：将肠管两端的玻璃管按图所示与胶管连接，做成回路，开动蠕动泵，其流速为5m1/min。5ml/min10min2.5ml/min，马上自供试液烧瓶中取样两份(1ml0.5m1各一份)，分别作为SD2ml，其后每15min9含量测定标准曲线的制作①SD2、4、6、8、10m1分别置l0ml1mll0ml带塞试管中，参加lmol/L5ml0.1％NaNO2

1m1，摇匀，3min0.5％氨基磺酸铵(NHSONH1m1,摇匀，放置3min，最终加1％二盐酸萘基乙二2 3 4胺溶液2m1，摇匀，放置20min，照分光光度法在550nm的波特长测定吸取度。以吸取度对浓度回归，得到SD在体鼠小肠吸取泵循环试验装置供试液烧瓶2.蠕动泵3.大鼠25mg250m11、23456m110m10.5m110m10.2mol/LNaOH5m1555nm曲线方程。样品测定①SDlmll0mllmol/L5m1SD550nm0.5ml10m10.2mol／LNaOH5m1555nm测定吸取度。操作留意蠕动泵流速调整等。假设蠕动泵上并未标出流速，可用量筒接流出液〔蒸馏水〕的方式确定流速。(2)由于小肠很细，小肠两端插上玻璃管后再洗涤格外简洁堵塞，防止的方法是先将十二指肠端插上玻璃管，回肠端找好后先用线扎紧(为以后找切口位置)，然后在扎线处切个小口。生理盐水(37℃)从十二指肠端插管处注入，洗涤内容物至净，再在回肠端切口处插上玻璃管。(3)插玻璃管时应留意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。(4)SDSD1ml10ml1mol/LHCl1m1，摇匀，以下操作按SD酚红比色测定的空白比照液为0.2mol/LNaOH。四、试验结果分别写出SD和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。SD和酚红样品浓度的计算依据SDSD度，并填于下表中。取样时 SD

大鼠在体小肠吸取量的计算SD 酚红 酚红间〔h〕 A 浓度

A 浓度

供试液体积

剩余药量循环前ACA’C’V=80ml00 0000C”V0 A C1

A’ C’1 1

V 0 1 C”1”40

PCV1 110.25 A2

C A’ C’2 2 2

V 1 12 C”2

P CV2 2

11.5)C”400.5 A

C A’ C’

V 2 2

1.5(C

C)3 3 3 3 3 C”3… … ….. …. … ….

3 33 1 2…(V 1.5)C ”40

n1t A C

A’

V n1 n1

PCV

1.5 Cn n n

n n n C”n

n nn

ii1不同时间SD剩余量的计算按上表中公式计算出不同时间的剩余药量，并求剩余药量的对数值。4.k和t 的计算以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一条直线，由直线的斜率求a 1/2〔a〕出k，并计算t 。a 1/2〔a〕五、问题与争论在体吸取试验方法的特点是什么?影响试验结果的主要因素有哪些？供试液中为什么要加酚红?一、试验要求了解磺胺类药物紫外分光光度法测定原理通过试验了解药物的体内分布二、试验原理药物在体内分布是指药物经吸取进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。药物分布打算于组织的血流量、药物对脂膜的集中速度及药物与蛋白质的结合程度。药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效药物。但假设药物在某组织消灭蓄积则可能产生毒性作用，所以一般药物的分布可以为药效学和安全性评价供给重要信息。通过组织分布争论，可以了解试验药物在试验动物体内的分布规律、主要蓄积器官或组织及蓄积程度等。组织分布试验通常通过给药后，于肯定时间取出各组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。NH2)离子化生成铵类化合物(－NH3+)，进而与亚硝酸钠起重氮反响，产生重氮盐。此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物(N-1-萘乙二胺)起偶联反响，形成紫红色的偶氮化合物。利用该呈色反响，承受分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。三、试验步骤标准曲线的制作取大鼠3只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并马上取出肝脏、肾脏及脑组织，用生1∶6加生理盐水〔脑组织按1∶3〕置玻璃匀浆器中进展研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，3000r/min10min1ml1∶120%三氯醋酸沉淀蛋白，3000r/min10min300010min后取上层血浆待测周密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液2ml〔以2ml为空白比照各60.1、0.25、0.5、1、5、10g/ml，脑组织液中药物浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、5g/ml，再各参加0.50.05ml3min0.51ml2min色剂〔0.05N-1-萘乙二胺〕2ml，摇匀。5min540nm组织分布试验3100mg/kg105、20、120min时，处死大鼠，马上取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后马上用滤纸吸干，准确称量组织重量。余下操作除不加标准液外，其他同标准曲线制作项下处理后，测定不同时间、不同组织中的药物吸取度。代入相应标准曲线，计算不同时间中各组织中ST四、试验结果各组织标准曲线方程各组织中药物浓度组织时间〔min〕5AC(g/ml)组织中药物量〔g/g〕肝201205肾201205心脏201205脑20120血520120五、问题与争论磺胺噻唑钠在大鼠肝脏、肾脏、心脏及脑组织的分布有何异同？组织分布争论有何临床意义？试验三 血浆蛋白结合率测定一、试验要求把握平衡透析法测定血浆蛋白结合率的原理和方法。把握血浆蛋白结合率在临床药动学中的意义。二、试验原理通常结合型与游离型处于动态平衡状态。药物与血浆蛋白结合符合质量作用定律，即：D+P

kk1 PD (1)k2k [PD]Kk1[D][P]2

(2)式中D为游离药物浓度，P为血浆蛋白浓度，PD为结合型药物浓度，kk1 2解离常数。K为平衡时的亲和力常数。在实际工作中通常用血浆蛋白结合率来反映药物与血浆蛋白血浆蛋白结合率 [PD] 100%[D][PD]血浆蛋白结合