原子力显微镜

关于原子力显微镜第1页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第一代：光学显微镜16世纪末，荷兰人Janssen发明了第一台复式显微镜1665年，英国科学家罗伯特·胡克用他的显微镜发现了细胞1680年，列文虎克磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍第2页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第一代：光学显微镜列文虎克观察到的“小动物”罗伯特·虎克观察到的细胞第3页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第一代：光学显微镜相较于过去两个世纪，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2μm。任何小于0.2μm的结构都没法识别出来。提高显微镜分辨率的途径是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。

第4页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第二代：电子显微镜1938年，德国工程师MaxKnoll和ErnstRuska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）1952年，英国工程师CharlesOatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）扫描式电子显微镜SEM透射式电子显微镜TEM第5页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第二代：电子显微镜电子显微镜的分辨率可以达到纳米级1.样品处理过程复杂2.要在高真空的环境下操作第6页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三第三代：扫描探针显微镜

1983年，IBM公司两位科学家GerdBinnig和HeinrichRohrer发明了扫描隧道显微镜（STM），但只能测导体和部分半导体

1985年，IBM公司Binning和Stanford大学的Quate研发出了原子力显微镜（AFM），弥补了STM的不足第7页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三STM基本原理

隧道效应：量子力学认为，即使粒子能量小于阈值能量，很多粒子冲向势垒，一部分粒子反弹，还会有一些粒子能过去，好像有一个隧道，故名隧道效应。隧道电流随探针样品间距离减小而呈指数增加．要求样品导电性要好，所以只能测导体和部分半导体。第8页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三AFM基本原理AFM是在STM的基础上发展起来的。所不同的是，它不是利用电子隧道效应，而是利用原子之间的范德华力作用来呈现样品的表面特性。吸引部分排斥部分Fpaird原子原子排斥力原子原子吸引力第9页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三AFM基本原理

（1）将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触。（2）由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的力，会使悬臂产生微小的偏转。（3）通过检测出偏转量并作用反馈控制其排斥力的恒定，就可以

获得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的图像。第10页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三仪器构成力检测部分位置检测部分反馈电子系统压电扫描系统第11页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

压电装置在X，Y，Z三个方向上精确控制样品或探针位置。

目前构成扫描器的基质材料主要是钛锆酸铅制成的压电陶瓷材料．压电陶瓷有压电效应，即在加电压时有收缩特性，并且收缩的程度与所加电压成比例关系．压电陶瓷能将1mV~1000V的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米的位移。压电扫描系统压电转换器——将机械作用和电信号相互转换的物理器件第12页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三力检测部分

检测的力是原子与原子之间的范德华力该部分是由悬臂和悬臂末端的针尖组成．微悬臂是探测样品的直接工具，它的属性直接关系到仪器的精密度和使用范围。第13页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

(1)极低的Z向弹性系数，其值为10-2~102N/m。这样的微悬臂将极其灵敏，能够检测出小于1nN的微小力。(2)足够高的固有频率（＞10kHz），使AFM扫描时可以跟随表面轮廓的起伏。(3)足够小的微悬臂：其长度必须在微米尺度才能符合要求。用光束偏转来测量悬臂的偏转时，其灵敏度反比于悬臂的长度。

(4)足够高的侧向刚性、以便尽可能地克服由于水平方向摩擦力造成的信号干扰。

力检测部分

对微悬臂性能的要求第14页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

(1)理想针尖的顶端应该是单个原子，这样的针尖能够灵敏地感应出它与样品表面之间的相互作用力。

(2)较高的纵横比，尽可能小的曲率半径。

(3)高的机械柔软性，针尖扫描时，即使撞击到样品的表面也不会使针尖损坏。

(4)高的弹性形变，可有效地限制针尖在样品表面上的作用力，从而减小对样品的损害，对柔软的生物样品特别有利。

(5)稳定的结构。力检测部分

对针尖性能的要求第15页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三位置检测部分当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得微悬臂摆动，产生微小的偏转，位置检测系统就是检测该偏转量的大小。悬臂偏转的检测有四种方法：(1)电容测量法；(2)隧道电流检测法；(3)光学干涉测量法；(4)光束偏转测量法；

为了得到高分辨的AFM，对检测方式一方面要求具有纳米级的灵敏度，另一方面还要求检测时不应该对微悬臂产生任何附加的作用力，避免造成信号误差。第16页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三电容测量法

微悬臂作为构成平行平板电容器的一块平板之一，而另一块平板则平行地位于微悬臂上方。微悬臂的偏转值将通过测量该电容器的电容值的变化得到。它的垂直位移检测精度达到0.03nm。位置检测部分第17页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

隧道电流检测法

这种检测法在微悬臂的上方设有一个隧道电极，通过测量微悬臂与隧道电极之间隧道电流的变化就可以检测微悬臂的偏转。位置检测部分第18页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

光学干涉测量法

利用光学干涉的方法来探测微悬臂共振频率的位移(或偏振光的相移)及微悬臂偏转的幅度。位置检测部分第19页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

光学偏转测量法它在微悬臂上的顶部设置了一面微小的镜子，通过检测小镜子上反射光束的偏转就可以得到微悬臂偏转的信息。位置检测部分第20页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

光学偏转测量法二极管激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器。通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。目前的AFM都是采用这种检测模式。位置检测部分第21页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三反馈电子系统控制系统主要有两个功能：(1)提供控制压电转换器X-Y方向扫描的驱动电压；(2)在恒力模式下维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定数值．计算机通过A/D转换读取比较环路电压(即设定值与实际测量值之差)．根据电压值不同，控制系统不断地输出相应电压来调节Z方向压电传感器的伸缩，以纠正读入A/D转换器的偏差，从而维持比较环路的输出电压恒定。

电子线路

计算机系统

为压电陶瓷管提供电压、接收位置敏感器件传来的信号，并构成控制针尖和样品之间距离的反馈系统。——连接计算机与扫描系统第22页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三AFM的三种工作模式

1.接触模式（ContactMode）

2.非接触模式（Non-ContactMode）

3.轻敲模式（TappingMode）第23页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三接触式工作模式

在接触模式中，探针的针尖部分保持与样品表面接触，其主要作用力是库仑排斥力。

微悬臂探针紧压样品表面，探针尖端和样品做柔软性的“实际接触”，当针尖轻轻扫过样品表面时，接触的力量引起悬臂弯曲，进而得到样品的表面图形。

vanderWaalsforcecurve第24页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三接触式工作模式的特点（1）该方式可以稳定地获得高分辨率试样表面微观形貌图像，有可能达到原子级的测量分辨率。（2）检测弹性模量低的软质试样时，试样表层在针尖力的作用下会产生变形，甚至划伤，这将使测出的表面形貌图像出现假象。（3）针尖和试样接触并滑行，容易使探针尖磨损甚至损坏。第25页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三非接触式工作模式

针尖在样品表面的上方振动，始终不与样品接触，测量的作用力是以范德华力为主的吸引力。

探针回到当前行扫描的开始点，增加探针与样品之间的距离，根据第一次扫描得到的样品形貌，始终保持探针与样品之间的距离，进行第二次扫描。在这个阶段，可以通过探针悬臂振动的振幅和相位的变化，得到相应的长程力的图像。vanderWaalsforcecurve范德华吸引力第26页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三非接触式工作模式的特点（1）探针和试样不接触，针尖测量时不会使试样表面变形，适用于弹性模量低的试样。（2）因针尖和试样不接触，测量不受毛细力的影响，同时针尖也不易磨损。（3）非接触扫描测量模式测量灵敏度要低些。第27页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三轻敲工作模式

一个外加的振荡信号驱动微悬臂在其共振频率附近做受迫振动，振荡的针尖轻轻的敲击表面，间断地和样品接触。

用处于共振状态、上下振荡的微悬臂探针对样品表面进行扫描，样品表面起伏使微悬臂探针的振幅产生相应变化，从而得到样品的表面形貌。vanderWaalsforcecurve第28页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三轻敲工作模式的特点（1）轻敲模式的分辨率和接触模式一样好。（2）对于一些与基底结合不牢固的样品，轻敲模式与接触模式相比，很大程度地降低了针尖对表面结构的“搬运效应”。（3）样品表面起伏较大的大型扫描比非接触式的更有效。（4）较软及粘性较大的样品，应尽量选择轻敲模式。第29页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三AFM假象

在所有显微学技术中，AFM图像的解释相对来说是容易的。光学显微镜和电子显微镜成像都受电磁衍射的影响，这给它们辨别三维结构带来困难．AFM可以弥补这些不足，在AFM图像中峰和谷明晰可见．AFM的另一优点是光或电对它成像基本没有影响，AFM能测得表面的真实形貌．尽管AFM成像简单，AFM本身也有假象存在．相对来说，AFM的假象比较容易验证．下面介绍一些假象情况：第30页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

1.针尖成像：AFM中大多数假象源于针尖成像．针尖比样品尖锐时，样品特征就能很好地显现出来。相反，当样品比针尖更尖时，假象就会出现，这时成像主要为针尖特征．高表面率的针尖可以减少这种假象发生．AFM假象第31页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

2.钝的或污染的针尖产生假象：当针尖污染或有磨损时，所获图像有时是针尖的磨损形状或污染物的形状．这种假象的特征是整幅图像都有同样的特征。AFM假象第32页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

3.双针尖或多针尖假象：这种假象是由于一个探针末端带有两个或多个尖点所致．当扫描样品时，多个针尖依次扫描样品而得到重复图像。AFM假象第33页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

4.样品上污物引起的假象：当样品上的污物与基底吸附不牢时，污物可能被正在扫描的针尖带走．并随针尖运动，致使大面积图像模糊不清。AFM假象第34页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

5.样品-针尖间的作用力太小：探针不能顺利地扫描样品而出现横向拉伸现象。此时可以通过调节振幅衰减量来调节作用力。AFM假象第35页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三在核酸研究中的应用（1）对DNA分子的成像及其自组装研究

1992年，Bustamante等利用AFM得到分辨率达分子级水平的可重复质粒DNA图像，并可估算分子宽度和高度，这是原子力显微镜研究生物大分子的一项重大突破。第36页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三（2）AFM不仅可以研究整个复合物分子立体结构和空间构象，同时还可以利用某些特殊抗体蛋白或RNA分子在缓冲体系中与DNA相互作用过程中重要结构参数变化来探究DNA区域分子构型，这是DNA研究的一个热点。（3）利用AFM可以控制生物大分子，调整生命的遗传与死亡规律，也可以在纳米尺度内将染色体的单拷贝基因复制扩增，切割剔除异常的碱基对，引起病理变化的逆转。在核酸研究中的应用第37页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三在蛋白质研究中的应用

⑴在蛋白质单分子外形上的应用

如在质子泵和离子泵研究上的应用；在与光合作用相关蛋白质研究方面的应用等。

⑵在蛋白质表面物理特性研究上的应用

如对蛋白质表面的粘弹性的研究；蛋白质静电特性的测量。⑶对蛋白质结构的研究

如对蛋白质的抗体标记或酶消化的鉴定；多肽末端移除的鉴定和多肽环置换或移出的鉴定等。第38页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三

⑷在蛋白质的功能特性方面的应用

例如，Daniel等应用AFM在纳米分辨率上显示了膜蛋白的时间依赖性构象变化及聚集运动，成为经典的研究方法。⑸对蛋白质单分子操纵

人们通过AFM操纵可以直接检测到该结构域的力学稳定性。AFM成像与操纵的联合使其能够宏观地从单分子尺度上对生物系统进行精确和可控的修饰和研究。在蛋白质研究中的应用第39页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三活细胞与微生物结构动态研究中应用(1)细胞或各种微生物表面结构成像

AFM现已广泛用于观察各种细胞的表面结构，如血红细胞、神经细胞、上皮细胞等。(2)对细胞间的相互作用进行观察

例如可研究动物胚胎移植中细胞的免疫排斥反应，病变细胞与健康细胞间的相互作用等。(3)识别正常细胞和癌细胞

AFM会赋予一个表明细胞柔软度的数值。研究人员发现，尽管正常细胞的硬度各有不同，但癌细胞比正常细胞要柔软得多。第40页，讲稿共46页，2023年5月2日，星期三AFM与其他技术联用（1）AFM与其他显微镜技术的联用