人肿瘤细胞非显带染色体制备张

人体肿瘤细胞

非显带染色体的制备实验目的熟悉：人肿瘤细胞染色体制备的基本原理和操作方法。肿瘤细胞染色体数目和结构的异常。实验原理目前大多数癌症都建立了相应的细胞株或细胞系，体外培养的肿瘤细胞多属于连续分裂的周期性细胞。收集生长旺盛的肿瘤细胞，加入有丝分裂阻滞剂秋水仙素预处理4-6h，再经过低渗、固定、染色等过程，就可获得肿瘤细胞非显带染色体。实验材料和用品1．细胞株人肿瘤细胞（7721、Hela等）

2．器材和仪器光学显微镜、超净工作台，CO2培养箱、培养瓶、离心机、冰箱、镊子、记号笔实验材料和用品3、试剂1640培养基、双抗（链霉素、青霉素）、小牛血清、0.25%胰酶、秋水仙素、0.075mol/LKCl、PBS缓冲液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、香柏油、擦镜纸、镜头清洗剂肿瘤细胞培养1-2天(70%~80%丰度）秋水仙素处理3h(终浓度为1ug/ml）低渗（加KCl

6ml，37℃水浴40min）

先预固定2min，在固定2次（每次30min）

制片并染色（吉姆萨染液染色20-30min

）实验流程镜检（观察并计数）

实验步骤1.1.细胞培养：将生长良好的人肿瘤细胞（7721、Hela等）铺入35mm细胞培养瓶中，加入5ml1640培养基（含10%小牛血清、双抗）后放置于CO2培养箱中培养约2~3天。

实验步骤2.终止细胞分裂：细胞生长至70~80%丰度时，加入100ug/ml秋水仙素2-3滴（终浓度为1ug/ml

），轻轻将液体摇匀，继续培养3h。3.收获细胞：摇匀培养液，移入10ml离心管，1000r/min离心3分钟，弃去上清，保留底部约1ml。实验步骤4.低渗处理：加入约5ml

0.075mol/LKCl溶液（预先37℃水浴），轻轻打匀，37℃水浴15min。5.固定：①预固定：加固定液（甲醛：冰醋酸=3:1）2ml，轻轻打匀，预固定2min，1000r/min离心5min，弃去上清，保留底部约1ml。②固定：加入固定液至8ml，打匀，固定30min，1000r/min离心5min弃去上清，保留底部约1ml。再重复固定1次。实验虏步骤5.滴片除：加驰至1m匆l固定坟液制蛇成细堡胞悬骄液，涨滴1~番2滴细拒胞悬穴液悬空15唤~2形0c脾m至冰加水中碍取出偷的载胞玻片申上，迅蛮速过铺酒精筑灯火征焰烤霸干。6.染色赛：在另标本牛片上东加数床滴吉躲姆萨帐染液恒，染申色20南mi蚂n，水勇洗。7.镜检唱：选劈燕择3~桂5个染浸色体携分散照好、斤没有字重叠派、团少聚性粥较好励的细杂胞，嫩在油叙镜下椒仔细葡观察始、计份数。注意拜事项团：1.秋水垃仙素体作用偿浓度莲与时裤间：静秋水系仙素师的作茄用是钱抑制羽纺锤洗丝和毅使染劲色体帖变短打，一敢般秋群水仙苗素溶支液的俗浓度勒与处仓理时融间有帮一定静的关岭系，届如果浴处理捞时间巾太短篇，则清标本鬼中的仔分裂煎细胞笼就少缠，相张反，要如果概处理帽时间经太长亮，则含标本酱中的治分裂盆细胞伟虽多灶，但更其染抄色体摧缩得现太短富，以饿致形坏态特淘征模吓糊，遮不容说易观摸察。注意恐事项珍：2.滴片兽的高毕度：浊高度誓过高,染色咳体分躬散范交围过仗大,甚至冈造成请染色遣体丢竞失;高度请过低,则染绝色体浇分散盼不良省。3.低渗肌低仆渗的顽目的妄是让亲水分插进入私细胞,使细鸦胞肿责胀、护染色牵体松锁散,是染忽色体济制备带过程塌中的剂关键球环节高之一辰。实验甩结果实验楼报告垂：