临床基因扩增检验操作规范

临床基因扩增检验操作规范

浙江省基因诊断中心浙江大学医学院附属儿童医院

尚世强一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析一、临床基因扩增检验实验室的

规范化设置及其各室的功能规范化设置：要求参照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。

1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有

专用的仪器设备。2.明确的标记，如加样器或试剂等。3.单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。4.使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。5.实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。6.各自的清洁用具。

各室功能：（一）试剂贮存和准备区

功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。（二）标本制备区

功能：临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

要正确使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。

（三验）扩纺增区功能晌：DN呈A或cD宇NA扩增。已制描备的DN洲A模板晋和合征成的cD套NA的加江入和晕主反弟应混温合液宿制备见成反妻应混池合液张等也柴可在职本区丘内进普行。在巢烂式PC祝R测定禾中，缴第二担次加过样必来须在知本区比内进养行。可降访低本浩区的铅气压顺以避啊免气酒溶胶捡从本烂区漏茂出。如有膊加样遍则应拢在超扣净台兰内进骨行。打开鞋反应鱼管前乖快速旨离心腾数秒且。（四父）扩禾增产磨物分获析区功能锻：扩增垃片段狐的测福定。膜上拴微孔程板上闸探针杠杂交动方法宏、So轧ut年he骄rn转移弯、琼娘脂糖浸凝胶拔电泳榨、聚滴丙烯梨酰胺游凝胶蝇电泳伤、核逼酸测丸序方趟法等屠。本区继是最锋主要币的扩张增产浩物污翼染来础源。泛溴化师乙锭积、丙党烯酰漫胺、初甲醛由或同凑位素走等有群毒或招致癌妇物质医，注扒意实医验人怜员的安全魄防护。负压揭条件动。二、艺各阶维段操抹作要滥求测定龟分析剩前的男标本胳采集激处理屿、测愚定中院的核膜酸提趋取、使扩增锣和产笋物分方析以伏及测属定后考的结尸果报厨告等瓶。（一丑）标岗本的汉采集临床尿标本巡寿包括ED种TA或枸橼午酸钠抗凝身全血嘴或骨棚髓、廊血清邀或血井浆、怨痰、铅脑脊冶液、炒尿及的分泌庆物等群。ED冬TA和枸劝橼酸狂盐是历首选向的抗涨凝剂允。不狂能使吹用肝膛素抗甜凝，敌因肝素酒是Ta德q酶的勤强抑仿制剂。玻璃粘器皿暮在使终用前新应高烤压处名理，否25谜0°烘烤4小多时以槐上可精使RN洁A酶永罚久性宝失活泳。临床款用于RN贺A（如HC冬V抱RN旷A）扩增俊检测交的血远标本毕应尽旅快（3小温时以输内）分橡离血闻浆，砖以避践免RN袖A的降黄解。（二爹）标清本的匹稳定汤化处巩理DN姿A：不需外特殊旺稳定书化处锦理。RN银A：异硫葡氰酸邪胍盐寻（GI规TC朵）可使DN坝A酶和RN葡A酶失很活。（三母）标乱本的垄运送可在广常温棕下通出过邮业寄运枕送，痰如用叨于DN洒A扩增尺检测弹的ED专TA抗凝尤全血浪及用挽于RN量A扩增溉检测择的GI结TC稳定烫化处寇理的近标本虏。未经椅稳定军化处标理，炸则必颂须速知冻后拜，放侧在干蚂冰中蚂运送杠。（四疼）标初本的贱贮存1.响血歌清/开血浆够等—省-焰70评℃2.来用村于DN秒A测定壁的已纯化瓣核酸样本肢—百4℃3.巴用界于RN姥A测定炊的已如纯化浆核酸踏样本绝—礼-8侨0℃4.症用撕乙醇桨沉淀调的核耽酸样耻本—仔-嫌20适℃5.悲G猾IT惰C处理最的RN区A标本鬼在室库温可接保存看7天（五唤）标萝本的永处理夹（核钩酸提妥取）抑制消物可能虚来源永于：标本巨本身礼（如交血红鱼素及绞其前唉体或巾降解若产物急）。核酸旅提取林过程超中残球留的桨有机宰溶剂捎（如取酚、祝氯仿痕等）摸。痰须壤液化淋处理晋。操作获时（长加裂姜解液俭后充顶分混旬匀，伤沸水另浴）注意任：①离眨心管吨不能伶插得姨过低泪，以直防进杆水；②水仰浴时贼不能谜加盖美，防窗管盖尝爆开掩；③水至浴时散间须斥准确四，1芽0±竖1mi帮n；④水络浴时烈不能返走开之；⑤左缠右手纺分开痒，左中手只胜接触怜样本席，右胶手只屯接触妙加样肿器及朗操作口仪器屋。（六灵）靶忆核酸产的逆脂转录贪（RT滔）和扩输增有多吴种因独素可令引起磨核酸喉扩增衡检测假阴寒性结果多，如勒扩增嚼靶核浇酸中截抑制晚剂存蛮在、Ta布q酶失枪活、稍退火丢温度称不对馅、Mg谜++浓度翠不佳若、患级者标狠本或斜试剂爽受污鹊染等秋。扩增袄仪孔岩中热悦传导损的均一祖性极为赏重要茄。RT勉-P衣CR操作仁注意岁：①标址本必袍须新穷鲜；②做RN功A标本呈的枪论头离辞心管净必须荣无菌秩；③冰泳上操阵作；④处彩理完盘后须延立即纸上机丑，不扯能放波置；⑤注愚意左补右手桌分开滥。（七干）扩割增产彼物的奇分析扩增汪产物也的测威定有驴各种财方法果，如骂电泳绍、限您制性圾酶切攀、斑而点印伙迹、研探针蹄杂交悼、测多序、嚼分光涛光度荡法定涝量等允。实时拴荧光帅定量PC谎R在荧向光定姨量PC香R基础拨上实森时监己测PC详R全过改程，像最后枪通过伸曲线压进行吹定量马分析拴。与一何般荧将光定摄量PC撤R使用促荧光禾强度努定量闭不同星，实荣时荧治光PC阔R一般重使用Ct（每仇个反闹应荧观光信欧号达进到设取定域睬值所争经的翁循环江数）阴定量案，Ct与模萍板初搭始拷翁贝数纯的对旗数成道线性羞关系肾。实时逆荧光PC锄R的优乐点：精密很度高贯，重掩复性句能好佩。Ta么qM锐an荧光罩定量PC捕R原理探针镇两端汇分别弄用荧虾光基兵团和筛淬灭染基团忽标记花，因蔑为距贡离相支近，扎基团宣相互商作用自，不直产生勾荧光像；探针醋与模钱板杂简交在锹引物拘区间辉内，揭当扩奸增进村行时朝，Ta票qDN仰A聚合靠酶的5’霜-3郑’外切监酶活柜性降葱解探就针，徐荧光身基团叮和淬问灭基令团分险开，版受激漆产生捷荧光心信号听；荧光桶信号各强度每与扩幕增产存物量狡成正阵比；三、PC筒R污染换与对萍策PC哈R污染艳分环思境污荐染与障反应蚀液污危染二驰种。缸常见PC轮R污染筋源有站三个霞：第一也、标喜本间裳的交多叉污迟染；第二弱、实槽验室披中克麻隆质边粒的煎污染芽；第三帝、PC涝R产物的污解染（Ca绿rr局yo燃ve脖r）。要防涝止PC沿R污染谈，必捧须做徐好以禾下3顽个环映节的辞工作乳：（一桐）污马染的净预防（二搂）污肝染源该的追雨踪（三盾）污陕染源壁的处标理（一范）污金染的季预防操作PC瞧R时，念按照阻下述英规则尘可有蓄效地停预防PC失R的污早染。1、PC纽奉R的前逃处理愚及后镇处理包要在数不同浇的隔离工镇作台轧上或侮房间赴内进党行。2、笋分装匹试剂卫，标良记批徒号3、即改进底实验哥操作说：(1工)胶带磨一次究性手泰套；(2胁)个避法免反骗应液刮的飞诉溅；(3公)袖用梢一次诞性移食液器比或吸泡头，挪吸头茎不要躺暴露绒于空气花，以则免产肿物气卖溶胶码污染唱；(4佣)侵操跳作多壁份样跳品时鸣，要棍先将哗可混攀匀的纵成分(dN膝TP烧s，缓冲皆液，挡引物题等)嫂一起筛制备效标准混合裕液(Ma要st谱er嫌m告ix录)；(5津)制备溪反应徒混合味液时爷，最氧后加应入样寨品DN狂A，加入DN务A后，喊在进结行下皱一步察操作轨前要岸盖紧反应香管。4、栋检查飘结果开的可我重复总性。（二突）污膛染源维的追兆踪1、揭阳、扯阴性针对照选择萍阳性棍对照犁时，君应选攻择扩齿增弱，且重复户性好的样秒品。阴性用对照关的选项择一争定要铺小心柱。不含谱模板DN斗A的PC推R试剂荷对照艘。2、奇常见读的环促境污捐染源鸟有(1患)建点劲杂交碍的点副样器茫；(2恶)增切塔片机占；(3遗)执离雪心机掉；(4再)尝切恨胶用暂刀或束微解耍剖刀讯；(5臣)埋浓肌缩用存具，包真空柄瓶；(6伏)盗电湾泳装叹置和枪紫外丑灯箱他；(7复)洗干午冰/净乙醇走或水披溶锅颈；(8狱)丘冰厦箱门侵把手拌、冷株冻架它和门喊把手掀。追踪请可疑腰的环办境污孩染源①封用覆去离竿子浸厚湿的族灭菌邪棉签健擦试怕可疑堤部分②躬在0.撕1ml去离宾子水开中浸斗泡；③蠢取5μl作PC闲R反应摩；④绒电络泳检夫查结因果。（三庙）污斧染源锐的处己理1.协环输境污垦染处灰理法（1依）稀酸闯处理摧法。对擦假试实御验阳匪性部谨位或旷器件此可用狂1mo厦l/LH妥Cl擦洗灭或浸截泡残前留DN杀A。（2饼）紫外称法：UV照射愧波长妥一般淋选择输25镇4/惜30刻0nm竿，需考饱虑PC妥R产物并的长预度与称产物棵序列锻中碱秧基的渠分布州。UV对长基片段温（50汤0bp以上霜）有绒效，女而对贺短片萍段效篇果不肌大。2.快反通应液内的污季染处典理法(1身)DN躁as尾eI法：PC取R混合危液（覆不加叔模板溉和Ta藏q酶）窗中加迈入0俩.5UDN呀as器eI，室温魔下作执用3轰0mi满n后，状加热旧灭活慢，加剩入模旷板和Ta焦q酶后肌即可械进行扎正常PC香R。优点梯：便音宜，萄不需但知道卸扩增DN治A序列错。(2踏)内切砍酶法：选择效识别萍四个层碱基刚的内匆切酶吹（如Ms回pI等）来，最影好几咬种合梢用，雁可克夺服其越识别转序列胀特异精的缺跳陷。仁方法慨同上墓，只视是Dn至as搭eI由内冈切酶唐（Ms承pI株10跪U）代替五，作驾用时缩慧间延昌长到撞1.库0～挪1.露5h。(3展)紫外狂照射贩法：反应羡中不滔加模言板与Ta馅q酶。(4蝇)尿嘧屯啶DN访A糖基干化酶畅（UN驳G）法：dU蜡TP代替特反应肥中的dT样TP，使产遮物中季含大容量dU却，U伍NG可去虫除dU，使失害去dU的位趁置，凝阻止Ta锄q酶的绕延伸割。PC庸R正常低循环涨前，获用UN肆G处理PC衡R反应雾混合睁液可躬消除PC射R产物伙的污倾染，标而UN唯G在正杆常PC年R循环专变性威一步香就会熄失活希，所它以，潮对含dU的新滔合成PC精R产物捷没有牛影响菜。T较A午T霉A暗TA右T域A介T铜APC鸡RA笔U刑AU温A己UUN屡GA孤AA加热A垂AA×PC寄R该法优点：①材去除尸任河献来源皮（包此括引考物在讽内）忧的污染行；②熄由于将污染岁的产苦物有缝大量dU存在廊，因此缠，UN损G处理今会彻楚底消泄除污宿染。③UN磁G处理姐与PC笑R扩增屿可在盆同一顺试管内进翻行。四、桂因操烘作欠爽规范勿导致允的问股题分化析（一因）实超验室榨仪器士设备1、衔设备估不齐肌全、蔬不配猎套，敞使得器实验丑结果毫不稳内定，拆引起护假性惑结果亿。旋涡翠混合联器，微政量加熊样器洗，正苦规的械紫外访透射足仪。RN附A如PC挺R样品地处理殖时，韵血清怨（或场血浆棚）中明加入准强烈变针性剂垮后，制血样以中的虚蛋白絮变性草、结仍块。吸头的与微凭量加护样器趋不配境套。2、PC庆R热循证环仪拢的差胆异或坡质量昨问题克。移液器：①严娱禁大丙力来绩回拧筋动；②严批禁调箩至容倍量之累外使样用；③第获二档愈为排饱空档拐，不协得作全吸取演之用页；④吸问头应金浸入艰液面挡2—谨3mm处吸取谅；⑤严狱禁将菌有液撒体的糠移液斜器平把放或形倒置椒；⑥混赌匀沉震淀时多，将虑吸头阔紧贴蛇于沉侍淀上客方管弹壁，达反复很吸取浸液体废，将忌沉淀伍反复洲混匀监，溶草解；⑦每仓周用偶75霉%乙冠醇清滨洗一券次，描若有德污染炕随时衡清洗讨。离心浪机：①离驱心前杯，离筛心管躁须配砌平；②将听调速给档打内至0宏档位荐，才慈能打千开电盾源开广关，醉逐渐慨升高始转速桥，直心至即量定转疲速；③定悟时旋挣钮不衣能强雅行归眉零；④转北头未担停止申时，冬严禁航打开待盖板护。（二稼）实互验室拥布局捎不合疏理引浸起的交污染音问题1、搂样品屿处理断不进奸行隔具离，样品姓中各耐种核变酸片段均碎会通摆过空亭气进柴行传灭播。2、PC梯R结果厨检测枪实验尾室和扎其它臂实验劣室在援一起，会出项现严谎重的箭扩增吩子污坛染。3、良仪器叫设备汽及工的作服趟等（院尤其烧是加加样器品）公用，也会链造成息严重瞎污染芒。4、储实验扁室操圣作垃饼圾（吸头舅、离安心管顶、样双品杯泳等）乱放，飘散匙在空繁气中跑的核擦酸片呈段、显病原傅微生蛋物可舅造成勉实验冷室污染巩。（三觉）PC桂R操作糟中存侨在问编题分元析1.阳性皇变阴券性2.阴性吓变阳砖性3.家PC江R结果猫不稳瞒定1.阳性贷变阴戴性(1)有些役阳性队病人乳，经过过PC罗R检测依后为余阴性钩，可稻能有暮两种汽情况俭：一是惧采集治标本摊方法蛾或部倒位不锻正确铅，二是晶如果紫病人灾取样眠部位萄病原驾体消暂失，唱需根施据病牙人的茎病理章情况退采样队。(2拨)标本袍保存渣不当鄙，可迁引起PC壳R失败鄙。收集起的标跌本乱裂放（浅未放高冰箱偷），种病原待体的叨破裂交，检兄测的树核酸弄降解瞒，失赖去了PC底R检测姻的模脉板或殖造成张标本滚污染货。2.阴性位变阳竖性常见炉的原牲因靠有以喘下6遍点：①赞加入写试剂教或样帅品时老引起触的交禾叉污川染（最呢好在豪加完街所有目其他诱反应避成分梯，包优括防衰止蒸姓发用限的矿顺物油导后才效吸加模板DN名A，将模姐板加工入微戚量离片心管岸后，药盖好泄离心翁管并睬用戴愉有手咐套的蹈手指族轻轻炕单击会管侧户壁，狂以摇助匀液控体，皮再作货瞬时竹离心掏[1既0秒所]，经使水椅相和姑有机烘相分档开）读。②加叨样器递通道宅易形双成气网溶胶绳，造肾成加逢样器蜘通道碧污染打，可适通过价使用村有滤楼筛的催吸头旬避免偿污染（将勇模板DN霜A加入PC艘R系统万时，裂注意兼切勿扭形成校喷雾孟，后仅者有絮可能摘污染录别的洁反应心，所击有并园非即晚用管似都应胃盖严请）。③费打开热标本摇管盖唉引起负样品进飞溅（打杆开前驾须瞬永间离么心）④操僻作时恭手套割引起腊的交剥叉污他染（拿皮过模进板DN蒙A管后零应更播换手滥套）⑤不暑明原滚因引刑起公垒用试矮剂如明液体探石蜡渣等污痕染（必狮须设免置一拒个不僵含模庭板DN柳A但含PC稿R系统章中所针有其酒他成亮分的涨对照亿反应乳。这赢一对旺照管耗须在财准备笛好所尚有其煎他PC绞R以后仿才进捕行吸月加）抓。⑥实船验室轻污染3.PC搏R检测穴结果硬不稳核定（1共）样基品处复理方播法不令当，滥标本星中杂齿质很喘多，血清伴标本控有蛋贞白质也、血逢红素滥、代猪谢产抚物等脉。蛋白割质—愿—DN窄A电泳昨带拖银尾血红洒素中敢的卟圆啉化心合物渴——躲抑制Ta苦q酶活幼性代谢塞产物嫩——跌干扰仔引物蹦配对（2漂）操术作不酱当带厦来的叹后果主要锻指不妈能严鼠格按查照说全明进丙行操浅作造仆成PC限R检测葛失败击。如HC抢V竞RN妹A坝PC针R样品农处理位试剂A、养B、途C和7熊5%鬼乙醇膊的操惑作过艳程。50μl血清急标本(剪标本惹可