羊的胚胎移植

羊的胚胎移植一、胚胎移植概述二、胚胎移植原理三、胚胎移植技术程序一、胚胎移植概述1.胚胎移植的发展历史2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用3.胚胎移植目前存在的问题4.影响胚胎移植的主要因素5.胚胎移植的经济效益6.胚胎移植的发展前景1.1国外胚胎移植发展史e是世界上一个提出胚植的人。1890年4月，re用兔作为实验动功地获得了世界上第一个动物胚胎移植后代Heae的和畜牧业的发展1900年，Heape的杰出接班人AMarshll和Johnamond总结了他的主要工作内容提出乳动物性季节念，也就是现在所说的发情周期。93年，奥地利维也纳的Biedl等进行了兔的植实验，但由于战争，直到1922年才报道了其研究结果。虽然他们做了70多个实验，但由于把输的胚胎移植到子宫结果只有一只受体兔妊娠这充分证明了胚胎和受体的同步性是非常重要的。1932年和1933和Horlahe第一次把胚胎移用在绵羊和山羊上.也因此成为了第一个国际胚胎移植协会先驱奖的获得者。1948年，张明觉用超数排卵技术从2只母兔获得88给7只受体母兔移植，成功地产出76只小兔，这的成功具有划时代的。1950年12月19日，33人d成功地获得了世一头胚胎移植牛犊0年代初全部采术回收胚胎和移植1964年Mutter等和1965年Sugie相继报道了非手术移植获得成功。70年代中植.974胎会(IETS)随后相继成立了美国胚胎移植协会加拿大胚胎移植协会、欧洲胚胎移植协会1.2国内胚胎移植发展史我国的胚胎移植研究起步较晚于20世纪70年代初才开始1973年首先在家兔上获得成功。1974年，中科院遗传所在绵羊胚胎移植上取得成功。1976年郭志勤、谭丽玲等在家兔胚胎和绵羊胚胎低温(100C)保持1和10天后移植成功。手和非手术法牛胚胎移植在1978年和1980年也相继成功1980年中国农业科学院畜牧所在绵羊胚胎超低温保存后移植产羔20世纪80了20几个省近30个单位相继开展胚胎移植研究工作20世纪90国逐渐进入了生产应阶段。生产应用比较好的地区主要是内、新疆和江、北京1.3羊的胚胎移植发展历史羊胚胎移植的商业化应用已有近40年的历史。在国际上，胚胎移植以牛的比例最大，其次为绵羊和山羊，其它家畜和动物胚胎移(等)的研一个比较热的研究方向。在国内，羊的胚胎移植起步较发达国家要晚一些，近十几年来，才逐渐推广开来，前几年由于波尔山羊的大量引进而使山羊的胚胎移植研究也相对多了起来。全国二十多个省进行了波尔山羊的快繁技术项目的实施。2003年我国共生产波尔山羊、良种肉用绵羊胚胎40000枚左右，移植受体30000只以上。2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用（1）超数排卵技术能充分利用优秀种母畜的繁殖潜力，几十倍或成百倍地提高母畜的繁殖效率和后代的增长速度。（2克隆技术可实现同卵双生同卵多生动物或无性繁殖后代，快速增加良种数量，或为育种提供材料。（3）可使优秀种畜遗传资源得到充分利用加速育种速度和畜牧良种化进程。(4）能用胚胎代替活畜运输，可在世界范围内实现品种交流，节约运输费用，减少疫病传播。（5）用于建立胚胎库或基因库，使畜禽良种、珍稀物种(基因)能长期保存对利用保存优良基因或拯救濒危灭绝动物具有重大意义。（6）别是显微受精技术。3.胚胎移植目前存在的问题（1）胎了NT的效率和实际应用（2）缺乏熟练操作技术人员及我国优秀畜种比例低（3T应用（4）胚胎冷冻保存任存在很多问题（5）胚胎采集和移植主要采用手术法的畜禽易造成粘连，受体重复使用受限制（6）超排效果不够稳定、移植成功率低、超排效果不够稳定4.影响胚胎移植的主要因素（1）超排技术：超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，可以为胚胎移植受体提供优质丰富的胚源保证优良母羊发挥最大殖生产厂家，使用剂量，操作程序等（2）移植胚胎的质量：胚胎质量的好坏是胚胎移植能否成功的关键因素通过胚胎鉴定要选择具有形态结构完整紧凑轮廓清楚、呈球形分裂球大小均匀色调和透明度适中及无附着的细胞和液泡等特征的一级（A、或二级（B级）胚胎进行移植。（3）供体、胚胎与受体的同期化程度：供、受体之间的子宫内膜要与胚胎的发育相同步这是胚胎从体外培养环境到体内妊娠必须具备的重要条件之一就要求供体与受发情时要同同步差为24h成大（4）移植胚胎的数目：一般认为，妊娠率与移植高质量的胚胎植12枚和3枚胚胎受体的妊娠率差异著，但产羔率却依次增加。也有研究报道，当移植胚胎数超过6枚时，妊娠率反而下降。据研究单侧移植:2-3枚效果最佳，进行大规模的胚胎移植时考虑受体羊体况产羔时繁重的接羔任务及产后受体羊的哺乳能力等。（5）操作技术：胚胎移植的每个操作环节在实际操作中都十分复杂，都直接影移植的成败。尤其手术操作要求熟练、、则胚胎会随移植液卵管而发生异位妊娠；如果速度太慢，、输卵管等暴露于空气时间过长增加污染率同时也增加了胚胎的损强拉硬拽都会产生不良影响（6）其它：受体本身的黄体发育与孕酮含量、解冻剂与脱防冻剂的类型胚胎移植的季节供体年龄及营养状况等因素都不同程度影响胚植的成功5.胚胎移植的经济效益胚胎移植是一个技术过程复杂各个环节环环相扣任何一个不其运作成本较高这使其中存在经效益上的险如果不是基于急需扩群、供济价值、育种目的，一般尽量采用自然。可创造较好的经济效益。6.胚胎移植的发展前景胚胎移植技术虽然已较成熟但对不同种属不同品种和不同个体的动物如何改善超排效果简化技术操作过程高移植妊娠率方面还有很多工作要做业的发展和动物胚胎工术研究入为胚胎移植技术提供了广阔的好的前景。绵羊胚胎移植技术的研究已经逐步由试验研究向商业化生产阶段转变这一技术在生产中的广用充分发挥了优良绵羊品种的遗传优势较快地实现在短时间内提高绵羊的良种化程不仅促进养羊业的发展也为当地经济繁荣带来广阔前景对绵羊胚胎移植产业化进行研究必将对肉羊新品种进和肉羊生产开发产生的推动作用。各种胚胎工程技术的研究和发展都需要胚胎移植技术作为必要的技术手段，所以动物技术的应用前景十分广泛第二节：胚胎移植的原理1.胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则1.胚胎移植的生理学基础1.1同受是供体胚胎受体提供相同的环境。1.2早期胚胎在一定时间内处离状态，为胚胎的收集了可能。1.3受子胚不为胚胎在受体内的存活提供了可能。1.4供体织体胚胎的遗传特性在孕育过程中影响2.胚胎移植的基本原则2.1.胚胎所处环一致性：⑴是供体和受体种属上的一致性。即二者属于同一物种，但这并不排斥种属不同但在进化史上血缘关系较近剖特点相似个体之间胚胎移植成功的可能性。⑵是生理上的一致性。即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降。⑶的胚胎应该移植到受体的输卵管内从供体子收集到的胚胎应该移植到受子宫内。：2.2.胚胎发育的期限从生理学的角度讲胎收集和移植的期：限不能超过周期黄体的寿命迟要在周期黄体之前数及胚胎附植之前进行因此胚胎收集多在发情配种后的3～8天内进行，受体在相同的时间内接受胚胎。2.3.胚胎的质量。在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素物理的、化、生物的)影响，移植的胚胎须鉴定确认是发育正常的.第三节：胚胎移植技术程序1.供体和受体的选择2.同期发情和超数排卵处理3.供体母畜的配种4.胚胎的收集5.胚胎的检查6.胚胎的保存与培养7.胚胎的移植8.供体和受体的术后观察1.供体与受体的选择传道疾病和传染性疾病。年龄在2.5~6周期正常；产羔60天以上，经观少有两个以上发情周期的母生产性能优良，符合本品种特征，精液品质良好。检在7在1.5--6观察有两个正常发情周期的母羊。2.同期发情和超数排卵处理绵羊同期发情(synchronizationofestrus)是利用某些外源激素人为地控制并调整一群母羊发情程。其药物机理一体母羊同时使用某种激素卵巢上卵泡的生发不提前到来创造条件黄体退化将导致母畜发情其实质是缩短了发情周期，使发情期提前到来。主要方法有：PG二次注射法、CIDR+PG法、MAP（甲羟孕酮）法.通常使孕酮阴道海棉栓埋植或埋植CIDR，被认为是控制母羊同期发情最可靠、最准确的方法。超数排卵（superovulation：是在母羊发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素巢比在自然状态下有更多的卵泡发育并排卵意义不大，母难产生反用超排技术可使羊每次排卵由1-4个增加到10-20家畜改良速度常的激素有FSHPMSGhc、PGF2α、PGc和孕激素等。影响超排效果的因素造成超排效果(获卵率和可用的胚胎数)不稳定的因素主要有两大:一类是动物因素,包括个体和遗传的差异、生理和营养状态、开始超排的日期、季节及其它影响动物的环境因素;另一类是药物因素,包括激素的半衰期、激素制剂中的FSH/LH比例、给药途径、剂量和频率等常用的超排方案1）FSH法FSH+G法、CIDR+FSH+PG等（2）PMSG：PMSG+hcG或PG研究表明，PMSG超排后适时给予APMSG可显著改善羊卵巢反应增加可用胚胎数(1997。（3）FSH理.Rejamahendran等在发情周期的第3d第4d给予2.5mgFSH常FSH程序回收到的卵子多4枚(P>0.05)每头母牛回收质胚胎增加1.6枚。但试验表明数并未提高(Lussier,)。目前羊超排多用H多次注射法，超排效果稳定，一般不会出起剂量和时间的误差。而PMSG使用方便，仅需注射1次，价格相对低廉，对动物刺激性小。然而余的PMSG会导致第二次排卵波的出现使超排个体往往存在较大的卵泡和一部分退化黄体这些大卵泡的存在会引起体内雌激素水平增高从而对卵子成熟精和胚胎的发育产生不利影响。故一般不采用PMSG对家畜进行超排处理.由于PMSG的半衰期较长，可以弥补FSH作用时间短的影响，PMSG不仅具有FSH的作用，而且也具有LH(促黄体素作用，由此通过FSH和PMSG的综合作用可以互取FSH和PMSG作用的方法以取得更好的试验结果(刘忠华，贺桂馨，李孝娟等2001)，以对胚胎移植等工作做好良好的铺垫应该注意实应用中由于其他的超排因素所产生的影响，所以对于FSH和PMSG的半衰期应该认真掌握，从而得到令人更加满意的试验结果。有人采取PMSG和FSH相结合的方法，用PMSG代替部分FSH进行超排处理。第1次注射FSH的同时，加注PMSG20IU显著超过了单使用FSH处理(岳奎忠2000)等(1998)用PMSG替代部分FSH获了和单纯使用FSH一样数可用胚，大大降低了的成本(杨梅，王旭光，施巧婷，2003).应用同一种超排方法不同的个体之差异较大除了个体本身的因素素的应用也起着很大的作用。激素剂量，卵巢上发育的卵泡数和排卵数量过多会导致卵巢体积的异常增大和卵子接受过程的机械障碍经输卵管伞接收到的卵子数量却有限剂量不足，则达不到预期的超排效果。杨梅等(2003)，桑润滋等(2003)等多人对激素的最佳剂量进行了研究但由于激素的生产厂家产批号不同，供体的状况也有差别，因此不能得到统一的标准。Moor等(198.提出激素制剂中FSH/LH的比例刺激卵巢反应中起着重等(1984)用FSH/LH比例最低的FSH制剂对绵羊和山羊进行超排结果超排率和胚胎产量提高激素注射途径的不同也影响着供体的超排反应。程发情周期内任意一天阴道埋CIDR记为第1d第10d换第二个CIDR第16d17d、1d，早晚分别注射FS（间隔12h，剂量逐步递减第19d取CID，早晚分别注射FSH24-8h发情，配种或输精记为0d第4d注射progestin第6d冲采胚3.供体母畜的配种超数排卵的母羊可以使用自然交配或人工授精配种人工授精胚胎可用率略低于自然交配一般建议以自然交配为好在种公羊不够的条件下可以采用采集鲜精进行人工授精配种前最好进行精液品质检查，对于精液活力差、浓度太稀的种公羊不建议使用。自然交配以试情发情后配2隔1h不接受爬跨为止每次配种完成仔细检查是否交配成功人工授精要严格按照操作规程进行，一般每只羊输0.2ml，无菌操作很关键，每只羊输2隔12h，可配种时注射半支3有助于卵母细胞集中排出受可提高胚胎育的同期率。4.胚胎的收集1.冲皿中。2.冲卵液采用PBSBrinstersmedu-3SOFWhittensmemHasF-10及TCM199等，在使用时一般需含1%~%的犊牛血清或0.3%~1%的牛血清蛋白。3.收集时间以母羊接受爬跨发情的当天作为第0d在第6d第7d多为囊胚或扩张囊胚、孵化囊胚。第5d以16-32细胞期、桑葚胚为主，一般第6d胚胎移植受胎率其他天。收集时应早于排卵后的第一天即最早要一卵裂之后，否则不易辨别是卵子是否。一般在配种后3~8。4.收集方法：手术法和非手术法后2-3输卵管冲，分顺向冲胚和冲胚；⑵子宫角冲胚供体羊发情后6-7.5采用子宫法后6-8路法和三路法。手术法采胚输卵管冲胚将冲胚管一端由输卵叭口插入约2-3cm（打活结或用钝圆的夹子固定。用注射器吸取37℃冲液5-19ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入一只手的手指在针头后方捏紧子宫角另一只手推注射器冲卵液由宫管结合部流入输卵管流入集成胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，注射器吸入冲卵液20-30ml（一侧用50-60ml，冲卵针头（钝形）从子宫角尖端插入，当确认针头在管宫将回收卵针头从肠钳基部的上迅速扎入冲卵液经硅胶管收集于集卵皿内用两手拇指和食指将子宫捋另一侧子宫角用同样的方法冲胚进针时避免损伤血管推注冲卵液时力量和速用液较多，检卵时用的时间较多。非手术法采胚常用于大家畜的胚胎收集如牛的非手术法收集胚连内口以免冲洗液经流出。只能当胚子宫角后进行。5.胚胎的检查解检查胚胎数量和发育情况开始捡胚将胚胎移植培养液中。中的比例确定胚胎级别。主要分：A、B、C、D级。AB级胚胎可以冷冻保存。6.胚胎保存体外生存时间，当需要时，升温移植胚胎常规保存可经短期或长期保产上进行鲜胚移植时，一般上午采集的，下午移植，或将胚胎净化后，在胚胎保存液（国产或进口）中室温条件下短期培养4-5天对胚胎的存活影响不大据报导将绵羊胚胎在0-13℃存10天仍然能移植成功（谭丽玲，1978，在冰箱中4-6℃.的条件下保存-天胚胎存活率也很理（丁红1995。胚胎的冷冻保存目前应用胚胎冷冻技术已经能够长期保存绵羊胚胎，并向着实用易行的方向。：⑴慢速冷冻⑵快速冷冻法⑶一步细管法⑷玻璃化冷冻⑸三步平衡冷冻法7.胚胎的移植移植时鲜胚移植供体羊与受体羊要求发即供体羊和受体羊同一天发情供体羊配种受体羊发情待移植鲜胚移植待发情后48—60小时进行手术移早则胚胎细胞分明显、卵巢黄体出血多易造成粘连；迟则胚胎进入子宫角，供、受体羊同步率不能超过±12小时，否则影响受胎率。受体羊术部位方法与取卵时相同移植分为输卵管移植和把致密桑椹胚阶段以后的胚胎移角前13胚胚2枚，解冻胚3-4枚，受体卵，把移入有黄体一侧的子宫角（1）手术法移植：在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况射器或移植管将胚胎注同侧子上端或输壶腹部（以胚胎发育阶段而定只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一起注入（2）非手术移植：主要对于大家畜如牛的非手术移植，将一只与人工受精操作一样另一只手将移植管插入与的子宫角内，注入胚胎。8.供受体的护理与观察（1）术后供受体的抗炎处理（2）健康状况检查（3）返情状况的检查（4）妊娠检查及妊娠确定察24h24h细待9d后用PG羊2mL，发情后强饲养管理和护理外，避免应激，做好保胎防流工作。引用文献[1]郭志勤等编.家胚工「M].中国学技出社，1998:36[2]SugieT.Successfultransferofafertilizedbovineeggbynon-surgicaltechniques[J].J 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