过氧化氢酶米氏常数的测定

过氧化氢酶米氏常数的测定河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室过氧化氢酶米氏常数的测定生物化学实验【目的】【目的】过氧化氢酶米氏常数的测定掌握米氏方程及其意义。掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方法和步骤。【原理】

1.米氏方程【原理】米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应速度v

与底物浓度[S]的关系符合米氏方程。v

=────Vmax[S]Km

+[S]Vmax：最大反应速度Km：米氏常数02468101214161820020406080底物浓度

[S]Vm2Km初速率

vVm动力学曲线Km值：可通过对米氏方程作图(V~[S]图)求出。在数值上等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度值。单位是mol/L(或mmol/L)。当v

=──

时，Km

=

[S]Vm2以不同的底物浓度[S]为横坐标，[S]/v为纵坐标，将各点连成一直线，并向纵轴方向延长，此延长线在横轴上的截距即为–Km值。2.汉斯方程2.汉斯方程

v

=────Vmax[S]Km

+[S]在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大的[S]，也只能得到趋近于Vm的反应速度，难以达到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为得到准确的Km值，可以把米氏方程转化为

y

=

ax

+

b

的直线方程，然后用图解法求出Km值。本实验采用汉斯作图法(HanesPlot)求Km值。将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程：(汉斯方程式)──=──

.[S]+──1Vm[S]vKmVm方程式两边取倒数再乘以[S]汉斯方程作图──[S]v1斜率=

──Vm0[S]Km──Vm–Km3.鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其Km值和Vm值。2H2O22H2O+O2过氧化氢酶2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2↑+8H2O过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2；反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度v；通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值。说明：KMnO4既是氧化剂，又是指示剂；Mn2+是滴定反应的催化剂。3.鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理

操作

1.肝匀浆制备【操作】1.肝匀浆制备将小白鼠处死，立即取出肝脏，去除胆囊及结缔组织，用0.45％的盐水洗净。称取1g肝组织加1ml0.45%盐水放入匀浆器，研磨成匀浆。取上述匀浆，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至1:10。取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至50ml(1:500)。取干燥的100ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。试剂(ml)1号瓶2号瓶3号瓶4号瓶5号瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分钟肝匀浆液1:50011111分别加入，准确记时10分钟10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定记录0.02mol/LKMnO4用量2.反应速度测定2.反应速度测定说明：①

试剂加量要准确；每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。10％H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。KMnO4用量记录精确度：0.0113.389.966.773.841.433.计算

①计算各管底物浓度试剂(ml)1号瓶2号瓶3号瓶4号瓶5号瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分钟肝匀浆液1:50011111分别加入，准确记时10分钟10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定记录0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物浓度[S](mmol/L)

反应速度v

(mmol/10min)

[S]/v(10min/L)3.计算①按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表H2O2浓度(mmol/L)×

加入H2O2的体积(ml)26ml(反应液总体积)[S](mmol/L)=38.46230.76920.37715.3857.692②计算各管反应速度试剂(ml)1号瓶2号瓶3号瓶4号瓶5号瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分钟肝匀浆液1:50011111分别加入，准确记时10分钟10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定记录0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物浓度[S](mmol/L)

38.46230.76920.37715.3857.692反应速度v

(mmol/10min)

[S]/v(10min/L)3.计算②按下式计算各管反应速度(mmol/10min)填入下表0.3310.3020.2620.2080.129

(mmol/L)=H2O2浓度(mmol/L)×

加入H2O2的体积(L)

–KMnO4(mmol/L)×消耗的KMnO4的体积(L)×5/2③碍计算斯各管[S远]/v试剂(ml)1号瓶2号瓶3号瓶4号瓶5号瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分钟肝匀浆液1:50011111分别加入，准确记时10分钟10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定记录0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物浓度[S](mmol/L)

38.46230.76920.37715.3857.692反应速度v

(mmol/10min)

0.3310.3020.2620.2080.129[S]/v(10min/L)3.计算③计算酱各管[S唯]/v值(1涛0m北in相/L娃)填入疾下表116.198101.88588.24873.96459.862④冈汉斯增作图3.计算④汉斯拆方程家作图疫求Km值和Vm值[S]v—–=—–+—–

KmVm1Vm[S]汉斯方程：汉氏作图–30–25–20–15–10–5

051015

2025303540[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)12010080604020–Km=–25y=1.8277x

+45.854—–

=46

KmVm以[S]为横直坐标策，[S]/v为纵湖坐标毅，制械作[S]/v~[S]坐标拆图。樱将测哀定各额点连液成一亿直线余，并狮向纵向轴方究向延话长与棋横轴狭相交脚，交隐点为半横截子距，单即–Km。纵介截距秘为Km/Vm。从坐秃标图麻查得–Km=–2拌5，即：Km=25棵m辰mo自l/番L。从坐货标图预查得Km/浓Vm=46，将Km值代闯入求群得：Vm=0.贺54僵3孤mm冰ol瞎/1延0m懒in。*E顶xc仰el汉斯已作图Ex屑ce怎l汉氏佛作图-35-30-25

-20-15

-10

-50510

1520253035404520406080100120140[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)–Km=–25y

=1.8277x+45.854—–

=46

KmVmKm=撑25谋m安mo零l/纠LVm=揭0.众54秒3惕mm凝ol拢/1勤0m辣in*E呢xc朵el双倒绩数作蚊图y=吊45府.7糖86x+遮1.蔬83品11Ex滔ce奸l双倒瞎数作冶图-0.1-0.0500.050.10.150.21234567891/[S](L/mmol)(0,1/Vm＝1.83)(–1/Km＝–0.04,0)1/v(10min/mmol)Km=顷25书m尚mo孝l/雷LVm=申0.播54奋6远mm厚ol坐/1运0m淋in*E伸xc砍el宜-E盛ad可ie魄-H敢of强st挂ee作图y=纽奉-2耀5.露05右1x+义0.招54寄670.10.20.30.40.50.6-0.00500.0050.010.0150.020.025v/[S](L/10min)v(mmol/10min)0.5450.0218Km=扎25田m编mo地l/肿LVm=临0.菊54滩5慌mm犹ol始/1疫0m抵inEx负ce燃l-记Ea尺di柏e-要Ho李fs摔te豪e作图*E腔xc悠el直线弄作图Ex腹ce循