第十一章动物细胞培养生物制药演示文稿

第十一章动物细胞培养生物制药演示文稿本文档共52页；当前第1页；编辑于星期三\13点46分优选第十一章动物细胞培养生物制药本文档共52页；当前第2页；编辑于星期三\13点46分1、成纤维细胞型细胞细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。成纤维细胞存在于肌肉、皮肤和骨骼中，代表有心肌细胞，血管内皮细胞等。本文档共52页；当前第3页；编辑于星期三\13点46分2、上皮型细胞细胞特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状。代表有皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。本文档共52页；当前第4页；编辑于星期三\13点46分3、游走型细胞细胞特点是：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。代表有神经胶质细胞。本文档共52页；当前第5页；编辑于星期三\13点46分4、多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原细胞。本文档共52页；当前第6页；编辑于星期三\13点46分接触抑制与密度抑制接触性抑制(Contactinhibition)是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。密度抑制(Densityinhibition)细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象本文档共52页；当前第7页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养的条件1、严格的无菌技术:细菌\真菌\支原体\病毒\交叉污染2、培养基对于营养要求非常苛刻，氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。包括：天然、合成、无血清培养基三种。（1）天然培养基动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。优点：营养价值高缺点：成分复杂、来源有限、成本较高本文档共52页；当前第8页；编辑于星期三\13点46分血清的生物功能1、提供基本营养：氨基酸、微生物、无机盐、脂类、核酸等2、提供激素及各种生长因子：胰岛素、肾上腺素、类固醇、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等3、提供结合蛋白：结合蛋白可以携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带微生物、脂肪和激素，转铁蛋白携带铁等4、提供保护作用：如通过促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤，如血清蛋白可以增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤，此外血清还提供一些微量元素和离子，防止细胞代谢中毒，如铯和硒等。本文档共52页；当前第9页；编辑于星期三\13点46分（2）合成培养基优点：成分已知，便于对实验条件进行控制。缺点：无法替代一些未知成分。解决途径：合成培养基中添加小牛血清，彼此互补。意味着合成培养基都是无血清培养基。目前常用的合成培养基：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等.MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的无机盐，组成简单。DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L）。本文档共52页；当前第10页；编辑于星期三\13点46分（3）无血清培养基血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点：（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用。（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。（3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。无血清培养基(Serumfreemedium,SFM)是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成。基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等。本文档共52页；当前第11页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养的条件3、其他溶液（1）平衡盐溶液（Balancedsaltsolution，BSS）主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。例如：Hanks液，注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。（2）培养基pH调整液大部分合成培养液都呈微酸性。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。HEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。中文名：4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸。本文档共52页；当前第12页；编辑于星期三\13点46分（3）细胞消化液从组织块消化分散得到单个细胞传代培养时分散细胞代表：胰蛋白酶溶液，水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞,两者常结合使用，增加效果。（4）抗生素溶液防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。本文档共52页；当前第13页；编辑于星期三\13点46分本文档共52页；当前第14页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养的条件4、培养条件影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、化学因素、物理因素。生长条件的控制主要包括温度、pH、渗透压、气体等。温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为36.5±5℃。pH：哺乳动物细胞的培养pH值范围为。渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发生皱缩或肿胀，甚至破裂。BSS溶液。气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2，二氧化碳培养箱很重要。本文档共52页；当前第15页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养的条件5、培养工具1923年卡雷尔（Carrel）（法国医学家、生物学家，1912年诺贝尔生理医学奖）设计了用于动物细胞培养的卡式培养瓶，培养鸡胚心肌组织获得成功。培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。培养瓶主要有高硼硅玻璃培养瓶与聚苯乙烯塑料培养瓶。本文档共52页；当前第16页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养方式动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类。1、贴壁培养：细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液、适用于所有类型细胞。缺点：扩大培养比较困难、投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。（1）贴壁材料要求：具有亲水性、正电荷。常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培养瓶等）、聚苯乙烯（96孔培养板等）对微载体而言还要求具一定三维结构。本文档共52页；当前第17页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养方式（2）贴附生长过程游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞会从瓶壁上脱落死亡。本文档共52页；当前第18页；编辑于星期三\13点46分细胞贴壁过程本文档共52页；当前第19页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养方式2、固定化培养可以采用类似植物细胞固定化培养的方法对动物细胞进行固定化培养。具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。固定化方法与植物细胞类似。3、悬浮培养细胞在反应器中自由悬浮生长。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。本文档共52页；当前第20页；编辑于星期三\13点46分动物细胞小规模培养1、培养瓶培养法1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要方法之一。本文档共52页；当前第21页；编辑于星期三\13点46分动物细胞小规模培养2、培养板培养法（微量培养法）现代体外培养技术最为常用的方法之一。基本要点：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。常用的培养板有6孔、24孔、96孔培养板。本文档共52页；当前第22页；编辑于星期三\13点46分动物细胞小规模培养3、灌注小室培养法1912年由伯罗设计了一种简单的灌注小室培养模型。基本要点：将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入和旧培养液排出。显著特点：营养液可以循环供应本文档共52页；当前第23页；编辑于星期三\13点46分动物细胞小规模培养4、转管培养法1933-1934年，盖尔（Gey）和刘易斯（Lewis）建立了旋转管培养方法，将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上旋转培养。旋转管培养方法克服了静置培养的不足，例如：细胞生长环境不均匀、不利于营养的吸收等，培养物可以交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织生长。本文档共52页；当前第24页；编辑于星期三\13点46分动物细胞原代培养接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养（Primaryculture）。一般持续1-4周。在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛。细胞多呈二倍体核型，这样的细胞称为原代细胞（Primarycell）。优点：1、组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征。2、在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，原代细胞是很好的实验材料，例如药物测试、研究细胞分化等。本文档共52页；当前第25页；编辑于星期三\13点46分1、组织块原代培养组织块原代培养是比较常用的简易的原代培养方法，也是早期动物细胞培养方法。以培养瓶培养为例：（1）剪刀剪碎组织形成1mm2的组织块，用吸管吸出组织块一一放入培养瓶内，一般每小块间隔为厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上。（2）然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，倾斜置于37℃的CO2培养箱内培养2-4小时后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。24小时后补充培养液，一般3-5天更换培养液。（3）一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落，组织块四周的贴壁细胞也逐渐形成层片。本文档共52页；当前第26页；编辑于星期三\13点46分2、细胞原代培养酶解制备单细胞：根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动物细胞进行培养。胚胎等组织细胞潜伏期短，第二天既可见生长，一周便可接连成片；成体组织来源的细胞潜伏期长，一般要一周左右。最常用的酶解液有胰蛋白酶和胶原酶，链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶一起使用。本文档共52页；当前第27页；编辑于星期三\13点46分热消化冷消化本文档共52页；当前第28页；编辑于星期三\13点46分动物细胞传代培养传代培养（Passageculture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。注意：每进行一次分离再培养称为传一代。这里的传代代数与细胞代数或倍增不同，“一代”是指从细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在细胞一代中，细胞约能倍增3～6次。悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，或者采用离心或沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。贴壁生长的细胞需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消化法进行传代培养。本文档共52页；当前第29页；编辑于星期三\13点46分传代培养方法1、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。3、2-5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添加培养液终止消化。4、吸出消化液，加入Hanks液轻轻转动，洗去残留消化液。5、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。6、计数，接种进行传代培养。酶消化法本文档共52页；当前第30页；编辑于星期三\13点46分动物细胞培养的一般过程动物细胞体外培养一般经过：1、组织获得与消化2、接种3、原代培养4、传代培养本文档共52页；当前第31页；编辑于星期三\13点46分本文档共52页；当前第32页；编辑于星期三\13点46分细胞培养过程分析与监测1、细胞形态检查及活力分析：倒置显微镜下观察；四唑盐（MTT）法可以对细胞活力进行分析（活细胞的线粒体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨[jì]并沉淀在细胞中）。2、pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，pH在7.2～7.4之间。CO2的积累使培养液pH下降。当超出缓冲范围时，培养液变黄，需3～4天更换一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染不易被发现。本文档共52页；当前第33页；编辑于星期三\13点46分细胞系与细胞株1.细胞系(Cellline)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系(Finitecellline)，能连续培养下去的为连续细胞系(Infinitecellline)。2.细胞株(Cellstrain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。本文档共52页；当前第34页；编辑于星期三\13点46分靶细胞的分离纯化靶细胞的分离纯化方法分为自然纯化和人工纯化。1、自然纯化是多次传代过程中，利用混合系中某一种细胞的增殖优势不断排挤其他类型细胞而最终被纯化的方法。此方法费时费力，选择纯化的细胞具有盲目性。2、人工纯化根据某一类型的细胞生长条件，抑制其他细胞生长，从而达到纯化的目的。（1）细胞因子依赖法：利用靶细胞对特殊细胞因子的需求与其他细胞分离。（2）反复贴壁法：利用不同细胞贴壁速度快慢的差异进行分离。（3）酶消化法：利用不同细胞对消化酶的耐受性差异进行分离。（4）机械法：硅胶软刷刮除非靶细胞。本文档共52页；当前第35页；编辑于星期三\13点46分细胞株的纯化细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并进行体外繁殖成为新的细胞群体。1、毛细管法：通过无限稀释法将细胞稀释成1个细胞/ml，然后在显微镜下用毛细管将细胞分离出来单独培养形成单克隆细胞群体。2、有限稀释法：将细胞悬液梯度稀释后接种到96孔板，进行一定时间的培养，理论上某一个孔中会有单克隆细胞群体。本文档共52页；当前第36页；编辑于星期三\13点46分适合工业化生产的细胞株原代细胞传代细胞二倍体细胞异倍体细胞融合细胞转化细胞基因工程细胞有限系细胞无限系细胞永生细胞正常细胞本文档共52页；当前第37页；编辑于星期三\13点46分转化细胞转化细胞是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由有限性细胞系转化为无限性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。转化细胞方法：1.细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。本文档共52页；当前第38页；编辑于星期三\13点46分常用细胞株CHO细胞(Chinesehamsterovarycell)：中国仓鼠卵巢细胞，亚二倍体(2n-1)，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、促红细胞生成素（EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。本文档共52页；当前第39页；编辑于星期三\13点46分常用细胞株Vero细胞（Verocell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。本文档共52页；当前第40页；编辑于星期三\13点46分常用细胞株293T细胞（293tcell）:

293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad5）DNA的永生化细胞。此细胞室温不贴壁，37℃几日后重新贴壁。本文档共52页；当前第41页；编辑于星期三\13点46分动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养：在人工条件下（pH值、氧气、二氧化碳、营养、温度等）进行高密度大量增殖细胞的技术。培养流程：组织--》消化--》原代培养--》传代培养（细胞系和细胞株）--》小规模培养（培养瓶、培养皿）--》大规模培养（生物反应器）--》代谢产物（分离、纯化）本文档共52页；当前第42页；编辑于星期三\13点46分1、转管/瓶培养系统转瓶培养是在转管培养基础上为扩大培养量而改进的。转瓶或转管固定在旋转支架上，倾斜角度一般为5º-10º。细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。本文档共52页；当前第43页；编辑于星期三\13点46分2、微载体培养系统微载体培养是将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴附，增加了贴壁细胞的贴壁面积，有利于贴壁细胞的大规模工业化培养。微载体指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。微载体一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。显微镜下的高密度微载体本文档共52页；当前第44页；编辑于星期三\13点46分优良的微载体应具有的特性不含能毒害细胞的成分；微载体须与细胞有良好的相容性，一般带正电荷；密度应略大于培养基；粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm；良好的光学透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌；应是非刚性材料；不吸收培养基中的营养成分；收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化；价廉，能重复使用。本文档共52页；当前第45页；编辑于星期三\13点46分微载体的类型目前市售（国际）种类有十几种以上：大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用的微载体主要是固体微载体，包括实心微载体和多孔微载体。实心微载体：细胞能贴附在微载体表面生长。多孔微载体：微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在微载体的内部生长。本文档共52页；当前第46页；编辑于星期三\13点46分微载体培养原理将对细胞无害的颗粒（微载体）加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。丝网微载体通气的培养基鼓