蛋白提取纯化实验方案

OchratoxinA〔OTA〕制备AC20H18ClNO6，403.8，是无色结晶化合物，学名为：7-羟基-5-氯-3,4,二氢-8-羟基-3-甲基异香豆素-7β-苯丙氨酸(L-phenylalanine-N-[5-chloro-3，4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H2-benzopyran-7-yl]carbonyl-(R)-isocoumarin〕。OTApKa4.4，pKa7.1；OTA333nm，易溶于极性有机溶剂，例如：甲醇、乙醇、苯、乙腈、乙酸OTα。试验仪器通风厨，pH仪，高效液相色谱；〔0.45uM〕，大钥匙，1ml，5ml试验材料及药品赭曲霉菌种，PDA培育基，玉米渣；〔200-300〕，CMC〔羧甲基纤维素钠〕，甲苯，乙酸乙酯，甲酸，乙腈〔色谱醇〕，乙酸试验步骤一、OTA的培育：1.3.44121L〕，冷却后倒平板，凝固后划线接菌3.4412，封口膜封口，28℃培育箱倒置培育。2.3.441260g250ml〔同时灭菌的有水，大钥匙，1ml〔18%〕，28℃、200rpm光培育，16-21〔21d〕进展毒素提取。二、OTA20ml0.1mol/LH3PO4200ml再将使用过的三角瓶等取出。用纱布漏斗过滤下午静置的溶液，收集滤液；再向玉米滤渣参加20ml依据滤液：3%NaHCO3=1：1，两者混合均匀后倒入分液漏斗中，静置分层，收集上层NaHCO3层；下层氯仿NaHCO3再洗一遍，静置回收氯仿层至瓶里，收集NaHCO3。NaHCO3pH2~3。两者混合均匀后倒入分液漏斗中，静置分层，收CHCl3水洗回收的氯仿，洗两遍。旋转蒸发：开电热〔60℃〕，真空泵，冷凝水，圆底烧瓶中加1/3氯仿，开电机降至两者液面平。〔真空压强在6~7，当压强增大时说明已蒸氯仿。蒸干圆底烧瓶呈黄色。薄层层析：玻璃板洗净晾干，硅胶粉1g：1ml0.8%CMC在研钵中沿同一方向搅拌混匀，至无气泡，倒在玻璃板上铺匀，晾干〔2-35-7天〕。95℃1.5甲醇洗瓶，点样〔距胶板纵向一端边缘2~3cm，留意点成一排直线，可用1ml注射器，枪加样时不要遇到硅胶板外表，样品枯燥后可再加一层，总量不超过2ml〕。开放剂：甲苯：乙酸乙酯：甲酸=6：3：1 乙酸乙酯150ml：甲酸50ml〕，在通风橱里倒约300ml开放剂在桶里，保鲜膜封口，静置饱和15min。0.5~1cm〔30〕取出，在通风橱里吹干。斗过滤〔此步较慢〕。旋转蒸干：甲醇温度大约设在72~74℃，压强在7~8。，0.45ｕm〔去除杂质以防止堵柱子〕，放在小瓶里，-20℃，锡纸避光。12.液相流淌相,乙腈：水：乙酸=100：100：14ml，30min气泡。100：990ml+10ml10000：990ml+10ml100*毒素100000：900ml+10ml10000*毒素液相的标准曲线换一台机器需用标品重做标准曲线。附图：菌种21dTLC20238116:22:5110wanbei,100000bei.55862.91mg/L*0.006L=335.1775mg20231238.719min；峰面积3198823.05峰高196923.50峰面积均值3116302.395 浓度5129.157mg/L 即12.7mmol/L。设备摇床药品试剂氯仿磷酸甲苯甲酸CMC盐酸甲醇乙腈乙酸玉米渣OTAuM，15ml，每个平皿约播50-1005(50000/100)*15ml*500uM*403.8=1.52g~3.04g平皿突变体检测：约20个平皿，约0.2guM，250ml，1000，50uM*250ml*1