基因工程综合性教学实验

1基因工程综合性教学实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆表达纯化吴海珍王善利赵健俞建瑛张惠展华东理工大学应用生物学系二○○五年一月第一局部桌碱性童磷酸链单酯吉酶基诉因的网定位啄、克驴隆与麻表达要实汽验旁流奸程导图帜碱性抹磷酸镰单脂汗酶基径因在奖染色旺体D帐NA瓣上的咏杂交税定位页――堵So街ut摊he渠rn祖B烧lo狭tt洗in江g酒生凳碱性清磷酸域单脂崇酶基掏因的女体外聚扩增穷――嚷PC慕R扩帆增懒故抹PC供R体棚外扩菠增片扬段的局克隆垮连接芒于T梯-载库体警――虎连接票涝顿连接乳产物红转化沈大肠光杆菌证受体查菌储――理转化跌市施转化士子质姻粒D叠NA诚的抽世提荣――潮快速而法制割备质普粒财树默转化航子的权鉴定柄――蒜限制双性内跟切酶碍酶切缸全鸭目的诉转化挺子D爱NA净的大潜量制科备跌――蛛碱法某抽提扭质粒解DN上A均芽役酶切姐回收遵克隆做的目乓的基喇因片漠段泡――瞒回收笛目的连基因传值候重组劳表达卡型质朴粒的候构建和――亩连接五、转牵化、僚鉴定垄性攻重组雪大肠韵杆菌状目的捕蛋白凶的表显达圾――止蛋白允电泳讯隶实绘验蚕路展线活1王D利NA多的酶登切旺摘要文崭本单瓶元主苹要介辫绍限蓝制性颗核酸里内切止酶的绸各种愧特性层、酶板的保印存方久法和甲使用气注意辨点，管多种似酶联晕合酶豪切的片常用吃策略埋等。冷1.阶1实短验原崭理纸DN宰A重泥组技社术中津的第毒一步效是从慰不同耐来源恰的D另NA拾〔染叉色体康DN很A或艺质粒星DN萝A〕折上将片待克供隆的遍DN插A片舞段特绵异性财切下便，同水时在交载体隆DN棒A分丝子〔胡一般男为质罪粒D取NA侵〕上坚翻开袄相对份应的茅缺口馒，然答后将悦两者衔连接余成重林组D拢NA巡分子候。这搞一特词异性站的切锡割过睡程常军由特蹦定的境限制浑性核史酸内眠切酶餐来完溪成。仅限制辱性核腐酸内蝇切酶社几乎吓存在稿于任呢何一占种原代核细对菌中愧，它律能在率特定至位置杂上催临化双轿链D恐NA堡分子静的断象裂，苹产生嗓相应由的限调制性晃片段娃。早颗在2拖0世趋纪5吊0年贷代初裹微生由物体侮内的控限制拐核修佣饰作拼用就谊已发携现，捐10俘年后币细菌鸦的限喘制和厌修饰防作用予的分辜子机凯制被驶说明帜。以虽大肠共杆菌付为例候，在里K株怠和B原株中脑都含赤有各递自不辱同的伏限制妖――妨修饰鉴系统丧，两杏种不吹同来嘱源的亿－噬产菌体胁〔摆K该和俭B坡〕长劫期寄讽生于米各自夹的宿燕主细昂胞中妖，宿幅主细励胞内瞒的甲愉基化愿酶已盐将其坟染色枯体D缘NA里和噬姐菌体弊DN宫A特暑异性犬的保拉护，受封闭如了自惯身所衔产生族的限行制性做核酸甲内切鼻酶的觉识别答位点葛，故仓它们咱在感咸染相归应的狡宿主盛细胞饥〔K茅株和孙B株盘〕时织DN工A不域被降淡解，妻因此写感染旗频率斩很高仁。当师它们下分别旱感染袍其他晒宿主欠细胞雹时，小由于慎没有捏特异回性的络保护肾作用捐，入溜侵的欢DN收A分肯子被岭宿主岔细胞恶的限歉制性比内切素酶切风割降跌解，喂从而原感染淹频率古急剧忧下降杠，普拜遍能酱低一肥或几理个数吧量极理。这稀一现赵象普辜遍存冶在与午原核图细菌绵中。搂但由杠于宿赔主细删胞内矩的降宜解作府用的舟不完惰全，遮入侵剃的D推NA适分子垄总有沸极少选数能递完整沈保存寨下来漂并得摘以在枝细胞株体内迫复制多，而营且在称复制婆过程剃中被礼宿主饼细胞殃的甲笨基化巴酶所府修饰违。这良修饰吴过的切DN勺A分苍子再吐重新鲁制备贵后导堪入该鼓宿主慧细胞良时，绑感染融频率像又能喊恢复待到原叮来的艇高位爷，即挠限制犯――将修饰阁作用降被解徐除。洒1.羞1.划1限树制性致核酸灶内切碍酶的诵分类特目前协在细挡菌中荡发现赏有6叶00毛多种淋限制连性核藏酸内勉切酶迷，根四据其淹性质次不同咳可分吓为三丸大类弹〔见帅表1级-1户〕。达其中想II响类限窜制性调核酸壶内切滚酶与校其所件对应姐的甲抓基化块酶是绪别离北的，六不属恭同一贡酶分遭子，针而且麦由于吉这类聋酶的杠识别视切割厉位点脆比拟饭专一必，因学此广杜泛用弊于D醉NA故的重佳组实麦验。竿I类互和I个II魔类酶究严格槽地说鸣应该教称为断限制撒――延修饰使酶，药因为原它们骄的限里制性绣核酸牙内切悔活性妹及甲厕基化典活性饼都作缘为亚被基的雹功能摸单位趣，包属含在企同一仿酶分贪子中百。靠表1副-1巡各类羡限制丙性内香切酶庸的特劳性足I类苍酶婶II弟类酶箱II蚂I类皇酶膏酶分蒜子狱三亚轮基双决功能劫酶销内切芒酶和男甲基支化酶露分开族二亚孕基双夕功能区酶却识别脆位点呀二分观非对似称序萝列咐4～退6b边p短烈序列夺，期大多捞数为遍回文美结构买5～喇7b述p非羊对称纤序列厕切割菌位点傻距离颠识别贩位点郑至少济1秩00惨0b膏p，论无特贯异性倚在识看别位欺点中冻或靠柜近识去别位队点乓在识瞧别位辫点下狼游2出4～丧26假bp笛处走限制勒性反射应与蜡甲基盼化反柏应截互斥鲁分开灿的反今应讽同时拦竞争罗限制家作用凳所需稍的辅武因子蔬AT些P、情Mg腔2+旗、劝S-隙腺苷夸甲硫笼氨酸哗Mg甲2+篮AT猫P、藏Mg依2+堤、S材-腺虎苷拖甲硫赚氨酸机〔非勺必需偷〕添DN更A重直组中拾的用楼途劣无箭有福无捕1.驼1.纤2伤II色类限才制性未核酸绞内切乖酶的歉根本杠特性务II序类限极制性怜核酸宋内切母酶是伴Sm塑it渣h等历人于倒19盈68撤年在嫌流感并嗜血侍杆菌伍d型公菌株咳中发塑现的哲。该反类酶瓜是一逐种分杨子量暖较小马的单配体蛋酿白，楚其双粘DN多A的居识别此与切唇割活摇性仅椒需要咱Mg亩2+现，且寨识别身与切卖割位蹄点的挣序列上大都该具有尤严格乏的特逗异性恼，因伏而在态DN多A重遭组实萌验中达广泛卫使用煎。香目前樱已分僻离出礼40压0余兼种I益I类晚限制称性核毁酸内桥切酶定，鉴缺定识艇别及们切割予位点弟的有抛30形0多洽种，同商品堪化的棕酶N券EB煤〔N彩ew雀E哗ng脂la纽nd吐B景io慧la税bs咐〕公街司品框种最滚多，拌达2夫20友余种崇，其贺中在感DN讽A重推组实剧验中泼常用拘的有克20港多种斤。这著些酶译的统锣一命摸名由搜酶来祝源的亿生物查体名谅称缩预写构衫成〔伞见图寇1-惹1〕棕图1撒-1唱限遍制性晃内切疮酶的漠命名腾原那么贤与示世例筒1.重1.艳2.暂1识目别位雅点师II腊类限锄制性掌内切胶酶的请识别辽位点串具有要18塔0拖°现旋转充对称业的回角文结渴构，型常用暂的识顾别序忆列往滑往为蜻6个爽碱基估对，找例如总Hi观nd恒II猜I的亲识别笋序列讨：城其中高一部纺分的相识别盯序列棋某一趟或某理两位症碱基畅并非抚严格拣专一秤，但蹲都在层两种捕碱基坊中具排有可朝替代照性，草这种诞不专煤一性恰并不降影响品内切允酶和编甲基棕化酶保的作纽用位钟点，度只是围增加贤了D颤NA齿分子浮上的巾酶识验别与惩作用资频率验，例鲁如A碑va题I的抖识别挺序列怎就是木典型渣的结肉构：泡 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