第5章细胞融合与单克隆抗体

引言细胞融合(cellfusion)一、概念又称体细胞杂交（somatichybridiazation）、细胞杂交(cellhybridiazation），在离体条件下用人工的方法把不同类型的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。本文档共114页；当前第1页；编辑于星期三\8点36分二、细胞融合的发展历史(一)“自发”细胞融合现象1838年Muller多核的肿瘤细胞1858年Virchow正常组织、发炎组织及肿瘤组织——多核细胞1873年Luginbuhl天花病人——多核体血细胞1875年Lange蛙类血液细胞发生合并细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第2页；编辑于星期三\8点36分细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第3页；编辑于星期三\8点36分细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第4页；编辑于星期三\8点36分(二)

重要事件1962年,(日)冈田善雄仙台病毒促细胞融合70年代,(华裔加籍)高国楠PEG促植物原生质体的融合80年代，电融合细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第5页；编辑于星期三\8点36分(三)植物细胞融合1972年（美）P.S.Carlson——杂种烟草现代植物细胞融合的开始1978年（德）梅歇尔斯——“pomoto”细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第6页；编辑于星期三\8点36分植物原生质体培养与细胞融合

(ProtoplastandCellfusion)植物原生质体培养植物细胞融合

细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第7页；编辑于星期三\8点36分(四)

动物细胞融合

动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第8页；编辑于星期三\8点36分肿瘤细胞与树突状细胞的融合细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第9页；编辑于星期三\8点36分人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合1978年(瑞士)埃勒门斯(美国)柯路斯细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第10页；编辑于星期三\8点36分人—鼠细胞融合本文档共114页；当前第11页；编辑于星期三\8点36分(五)细胞融合的诱导诱导融合的方法:物理法:电场刺激、激光、显微操作化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、高钙离子法生物法:仙台病毒细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第12页；编辑于星期三\8点36分不同细胞融合的条件及其主要应用来源前处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒、PEG、电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG、电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PEG高产优质新菌种细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第13页；编辑于星期三\8点36分1、仙台病毒诱导仙台病毒(Sendalvirus)也称日本血凝病毒HVJ，属粘病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第14页；编辑于星期三\8点36分融合的可能机制：

病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第15页；编辑于星期三\8点36分融合过程：1.病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞粘着成堆，在4℃冰浴中细胞紧密靠近，但不发生融合。2.37℃温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成通道，细胞质流通、融汇。3.病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过程约15～30分钟。4.细胞核也相互合并,完成细胞融合细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第16页；编辑于星期三\8点36分2、PEG诱导PEG——聚乙二醇(polyethyleneglycol)商品名：卡波蜡(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2·CH2)nOH实验室用PEG平均分子量在200－20,000一般：<1,000——液体

>1,000——固体常用分子量：4000—6000细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第17页；编辑于星期三\8点36分聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程本文档共114页；当前第18页；编辑于星期三\8点36分融合的可能机制？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之故。

？细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第19页；编辑于星期三\8点36分★融合机制种种1）“脂无序”模型Lucy，1970-19752）Ca2+诱导的侧向“相分离”模型Papahadjopoulos19783）六角形HII构象与膜融合CullisandHope19784）Ca2+诱导局部脱水与膜融合WilschutandHoekstra19845）渗透模型与膜融合Lucy19866）质子泵驱动膜融合刘树森1986

膜融合过程大体概括为两大阶段：首先是两膜脂相互聚合和接触，其次是接触部位的局部脱水，形成不稳定中间结构，使膜脂发生混合而最终导致膜的融合。本文档共114页；当前第20页；编辑于星期三\8点36分显微镜下细胞融合过程本文档共114页；当前第21页；编辑于星期三\8点36分细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第22页；编辑于星期三\8点36分初步分析

可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第23页；编辑于星期三\8点36分PEG诱导过程注意事项：

控制与分子量、浓度和处理时间悬浮法：将细胞悬于40～50％的PEG4000进行融合，处理1～2分钟为宜。离心法：先将细胞混合物悬于30～40％的PEG4000，再离心进行融合，则可适当延长融合时间，以5～8分钟为宜。细胞融合(cellfusion)pH值以pH7.4～8.0为宜，或略偏碱性pH8.0～8.2。

辅以5～15％的DMSO或在融合前用PHA处理一下，效

果更好。本文档共114页；当前第24页；编辑于星期三\8点36分PEG融合法优点

效率高材料方便，操作简易效果稳定PEG融合法缺点

对细胞有毒性细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第25页；编辑于星期三\8点36分3、物理电融合诱导机制在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化,使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第26页；编辑于星期三\8点36分电融合诱导法原理示意图细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第27页；编辑于星期三\8点36分电融合优点：融合效率高，可达50～80％产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。

操作简便、稳定，但需设备。对细胞无毒害作用。可在显微镜下观察操作。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第28页；编辑于星期三\8点36分融合率融合细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数

×100％融合率=细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第29页；编辑于星期三\8点36分4、植物细胞融合基本过程去除细胞壁以获得大量的原生质体诱导细胞融合形成杂种细胞细胞相互靠近形成细胞桥–最关键的一步胞质渗透细胞核融合筛选,培养,促进细胞分裂,分化,从细胞团,愈伤组织到最后成株细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第30页；编辑于星期三\8点36分5、动物细胞融合基本过程动物单个细胞的获得组织的获得组织的消化诱导细胞融合形成杂种细胞筛选，培养细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第31页；编辑于星期三\8点36分细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第32页；编辑于星期三\8点36分植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合的原理细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞融合的方法去处细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（显微操作、电融合）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第33页；编辑于星期三\8点36分6、影响细胞融合的因素亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融合；表面光滑者较难融合。(2)细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易

融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧

利希氏腹水癌细胞融合时，于37℃振摇时易于融合，且

融合效率与病毒量呈正比。但在34℃振摇则融合率下降。

在37℃时不振摇则几乎不融合。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第34页；编辑于星期三\8点36分(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大．缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生

变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+．但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度

一般为0.1mol/L(6)最适合的pH为7．4—7．8之间，在此范围之外，融合率均较

低。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第35页；编辑于星期三\8点36分7、融合细胞的特征及其意义染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失 细胞融合(cellfusion)理论研究——基因定位和绘制基因图工作中十分有用应用价值——单克隆抗体、植物育种本文档共114页；当前第36页；编辑于星期三\8点36分细胞融合(cellfusion)1进行基因定位，绘制人类基因图

家系分析法、细胞融合法、基因剂量效应法、重组DNA法、分子杂交法、限制性片段长度多态性技术、脉冲电泳法（PEGE）2诱导PC染色体3体细胞杂种的致瘤性分析4遗传缺陷的基因互补5分化功能表达调控的研究6淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体7植物细胞的原生质体融合培育杂种植株8核质相互作用关系9基因治疗10疾病诊断本文档共114页；当前第37页；编辑于星期三\8点36分8、融合细胞类型同核体（homokaryon）异核体(heterokaryon）多核体（polykaryon）异胞质体(heterocybrid)细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第38页；编辑于星期三\8点36分

同核体(homokaryon)同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第39页；编辑于星期三\8点36分异核体(heterokaryon)

非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第40页；编辑于星期三\8点36分多核体(polykaryon)

含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第41页；编辑于星期三\8点36分异胞质体(heterocybrid)

不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第42页；编辑于星期三\8点36分9、杂种细胞筛选方法（1）遗传互补筛选法（2）抗性互补筛选法（3）生长特性筛选法（4）物理特性筛选法细胞融合(cellfusion)本文档共114页；当前第43页；编辑于星期三\8点36分5.1.1杂交瘤单克隆抗体技术的原理5.1.2杂交瘤制备过程5.1.3单克隆抗体的大量制备5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第44页；编辑于星期三\8点36分免疫系统

由淋巴器官、组织、细胞共同构成。免疫器官：中枢免疫器官：骨髓、胸腺、（鸟、禽）法氏囊外周免疫器官：淋巴结、脾、扁桃体等免疫细胞：造血干细胞、淋巴细胞（T、B、NK）、白细胞等。免疫分子：抗体、补体、细胞因子、干扰素等。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第45页；编辑于星期三\8点36分胸腺骨髓中枢淋巴器官外周淋巴器官扁桃体，淋巴结淋巴结脾淋巴管肠系膜淋巴结本文档共114页；当前第46页；编辑于星期三\8点36分T细胞和B细胞的分化5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第47页；编辑于星期三\8点36分T细胞介导的免疫应答一、抗原的识别与递呈（感应阶段）二、反应阶段三、效应阶段四、细胞免疫的生物学效应5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第48页；编辑于星期三\8点36分一、抗原的识别与递呈（感应阶段）（一）APC对抗原的递呈（二）T细胞的双识别5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第49页；编辑于星期三\8点36分抗原呈递细胞(antigen-presentingcell)一种特殊类型的细胞，携带细胞表面MHC（主要组织相容性复合体）II类分子，涉及抗原的加工和呈递给辅助T细胞。

5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第50页；编辑于星期三\8点36分5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第51页；编辑于星期三\8点36分T细胞活化的第一信号二、反应阶段由TCR识别并结合抗原性多肽传递抗原信号；CD4、CD8分子分别识别MHC-II类和MHC-I类分子。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第52页；编辑于星期三\8点36分T细胞活化的第二信号又称协同刺激信号，由众多协同刺激分子与相应受/配体结合介导，主要是B7/CD28分子对之间的作用。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第53页；编辑于星期三\8点36分T细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进一步促进T细胞活化、增殖。若TCR特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信号，则T细胞被诱导呈不应答。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第54页；编辑于星期三\8点36分（三）T细胞的增殖和分化CD4+TH分化为：

TH1CD8+CTL（TC)分化为：有杀伤效应的CTL（TC)5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第55页；编辑于星期三\8点36分Tc杀伤细胞5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第56页；编辑于星期三\8点36分细胞免疫应答5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第57页；编辑于星期三\8点36分体液免疫应答

5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第58页；编辑于星期三\8点36分抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导发生免疫

应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效

应淋巴细胞，并在体内外与之反应的物质。

5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第59页；编辑于星期三\8点36分能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性：(1)外源性机体以往从未接触过的外源异物或异体；(2)结构性分子量在10，000以上的大小，分子表面有稳定

的环状结构基团(而非线状基团)作为识别点；(3)特异性由于抗原有不同的决定簇，产生相应的抗体与

抗原间的反应是特异性的。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第60页；编辑于星期三\8点36分抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一

类糖蛋白,能与相应抗原特异的结合，产生各种

免疫效应（生理效应）的球蛋白。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第61页；编辑于星期三\8点36分抗体(Ig):（Immunoglobulin)抗体分类：

IgG、

IgA、

IgM、

IgD、

IgE抗体结构5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第62页；编辑于星期三\8点36分人体内的五种抗体本文档共114页；当前第63页；编辑于星期三\8点36分

抗体作用的机理中和反应聚集反应沉淀反应补体活化5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第64页；编辑于星期三\8点36分

每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，而由这一个细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody)。5.1单克隆抗体技术一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。

本文档共114页；当前第65页；编辑于星期三\8点36分单克隆抗体技术的基本原理

Kohler和Milstein于1975年将正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）、瘤细胞（如骨髓瘤）两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。5.1单克隆抗体技术GeorgesJ.F.Kohler

CésarMilstein利用细胞融合技术，将已免疫过的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在由此形成的单个杂种细胞中，B细胞提供产生单一型抗体的遗传信息，瘤细胞提供连续增殖的遗传信息。因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁殖。本文档共114页；当前第66页；编辑于星期三\8点36分1.单克隆抗体技术优势随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量（专一性）要求越来越高数量多:传统的实验动物马,兔等免疫不方便质量高:大动物免疫难以做到单克隆用细胞融合技术获得单克隆抗体综合了两方面优势：淋巴细胞肿瘤:能不断增殖，没有产生专一抗体能力。从脾脏得到淋巴细胞:能产生专一抗体，不能不断增殖。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第67页；编辑于星期三\8点36分

高度均一性：纯度很高的均一性抗体

高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应

大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代

2单克隆抗体的特性5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第68页；编辑于星期三\8点36分5.1单克隆抗体技术单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。本文档共114页；当前第69页；编辑于星期三\8点36分3亲本细胞的选择

骨髓瘤细胞：1.本身不能分泌抗体2.选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞5.1单克隆抗体技术

B淋巴细胞：1.经特定抗原免疫能产生目的抗体的动物淋巴细胞2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系本文档共114页；当前第70页；编辑于星期三\8点36分4融合细胞的选择原理1964年Litterlefield——HAT培养基

H—Hypoanthine次黄嘌呤

A—Aminopterin氨基喋呤

T—Thymidine胸腺嘧啶脱氧核苷5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第71页；编辑于星期三\8点36分原理：

正常及普通癌细胞不但具有利用培养液中的谷氨酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力，而且当这条主要途径被氨基喋呤（A）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的作用下，借此应急通路来合成DNA的能力。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第72页；编辑于星期三\8点36分嘌呤合成通路的阻断本文档共114页；当前第73页；编辑于星期三\8点36分细胞内DNA的生物合成途径主要生物合成途径应急补救途径氨基喋呤A次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸DNA5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第74页；编辑于星期三\8点36分5.1.2杂交瘤技术过程免疫动物融合细胞的制备两种细胞杂交融合分装培养、筛选抗体检测杂交瘤细胞的克隆冻存及单克隆的大量生产5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第75页；编辑于星期三\8点36分一、免疫动物目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第76页；编辑于星期三\8点36分常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：稳妥；优势克隆省时；省抗原省时操作繁琐5.1单克隆抗体技术体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。本文档共114页；当前第77页；编辑于星期三\8点36分常规免疫法：第1次免疫：抗原+弗氏完全佐剂第2次免疫：抗原+弗氏不完全佐剂第3次免疫：抗原不加佐剂第4次免疫：抗原不加佐剂(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射)5.1单克隆抗体技术皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：本文档共114页；当前第78页；编辑于星期三\8点36分二.融合细胞的制备

脾淋巴细胞的制备：

1.放血致死免疫的小鼠，无菌操作取脾脏，去胞膜；

2.用RPMI-1640或DMEM培养液清洗后，放在盛10ml培养液的

平皿的双层铜网上；

3.用注射器内玻璃管将脾淋巴细胞轻轻挤压到培养液中；

4.计数后将细胞液装入加盖离心管置冰箱备用5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第79页；编辑于星期三\8点36分骨髓瘤细胞的制备：多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。本文档共114页；当前第80页；编辑于星期三\8点36分骨髓瘤细胞的制备制备过程：1.主要源于P3-Nsl-Ag4等骨髓瘤细胞系2.选择形态好的骨髓瘤细胞，0.2%台盼蓝染液，计数3.1500rpm离心，弃上清液，加培养液清洗后再次离心注：在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，

活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第81页；编辑于星期三\8点36分三.两种细胞杂交融合1.按4:1-10:1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞混匀于同一个离心管中；2.离心，弃上清液.3.置于是37℃水浴中，摇动离心管逐滴加入的50%PEG，1分钟内完成，水浴中继续摇动1-2分钟；4.沿管壁加入10ml培养液，混匀稀释PEG，终止其诱导作用；1000rpm

迅速离心1分钟，弃上清液。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第82页；编辑于星期三\8点36分四.分装培养：HAT培养基筛选杂交瘤细胞1.离心后的混合细胞中加入HAT培养液，使浓度达到2*105个

细胞/0.1ml培养液2.按每孔0.1ml细胞稀释液加入96孔培养板中，加盖密封后置5%CO2培养箱37℃培养3.次日检查有无污染，若正常，换液（HAT培养液），以后隔

日一换4.两周后改用HT培养液，换3-5次后改用D-15培养液培养未融

合的脾细胞和骨髓瘤细胞5-6天后逐渐死亡5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第83页；编辑于星期三\8点36分通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。五.杂交瘤细胞的筛选和克隆化5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第84页；编辑于星期三\8点36分融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+

，能够生长）5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第85页；编辑于星期三\8点36分细胞融合的选择示意图本文档共114页；当前第86页；编辑于星期三\8点36分抗体检测抗原结合法用125I放射性元素标记的抗原第二抗体法-酶联免疫吸附测定法（ELISA）荧光活化细胞分类器法5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第87页；编辑于星期三\8点36分利用培养基对单抗进行鉴定的过程本文档共114页；当前第88页；编辑于星期三\8点36分酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第89页；编辑于星期三\8点36分单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法离子交换层析

A蛋白-Sepharose亲和层析5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第90页；编辑于星期三\8点36分利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体5.1单克隆抗体技术六、杂交瘤细胞的克隆化培养本文档共114页；当前第91页；编辑于星期三\8点36分有限稀释法通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。本文档共114页；当前第92页；编辑于星期三\8点36分软琼脂培养法在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。本文档共114页；当前第93页；编辑于星期三\8点36分体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水

体外：无血清培养基悬浮培养等七、冻存及单克隆的大量生产本文档共114页；当前第94页；编辑于星期三\8点36分单克隆抗体的规模化生产

杂交瘤细胞直接植入动物体内：1.将106-107的单克隆杂交瘤细胞，由皮下植入同系或组织相容正常的小鼠的体内，约过两周后，在小鼠的皮下形成相应的移植性肿瘤，用这些肿瘤再去接种更多的小鼠。2.在肿瘤出现后的一段时期，通过多次采血得到含单克隆抗体的血清，每ml血清内约含1-10ml的抗体，但取血量有限。3.因此，可将相同数量的单克隆抗体细胞植入在3-10天前经腹腔注射0.5ml异十八烷或其它矿物油的初次致敏的小鼠腹腔内。在接种后的二周左右的时间内，经穿刺而得到5-10ml的腹水，内含单克隆抗体的浓度5-20mg/ml5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第95页；编辑于星期三\8点36分单抗的大规模生产1）诱生腹水将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106

杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗本文档共114页；当前第96页；编辑于星期三\8点36分

生产技术现状：现在的生物技术公司一般采用生物反应器悬浮培养的方法生产单克隆抗体。由于杂交瘤细胞的高密度生长，使得抗体效价可达到10~100mg/ml。美国Damon公司的专利方法是将细胞培养在一种中空的微球体内，这种被称之为微囊的微球体外面由多孔膜包裹，使内部生长的杂交瘤细胞受到多层保护而不受环境影响。此种微囊技术生产的抗体可达0.1-1g/L。抗体的生产达到一定的规模。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第97页；编辑于星期三\8点36分动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体杂交瘤技术操作流程图解本文档共114页；当前第98页；编辑于星期三\8点36分影响因素分析（一）污染（二）融合后杂交瘤不生长

PEG有毒性或作用时间过长 牛血清的质量差，用前未严格筛选 骨髓瘤细胞污染了支原体

HAT有问题（A过高或HT含量不足）5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第99页；编辑于星期三\8点36分（三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A

抵抗细胞所致 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好 细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长；也可能发生染色体丢失。5.1单克隆抗体技术本文档共114页；当前第100页；编辑于星期三\8点36分5.2.1EB病毒转化技术5.2.2细胞工程单克隆抗体技术5.2.3人单抗制备技术的发展5.2人源性单克隆抗体制备本文档共114页；当前第101页；编辑于星期三\8点36分5.2人源性单克隆抗体制备主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。本文档共114页；当前第102页；编辑于星期三\8点36分本文档共114页；当前第103页；编辑于星期三\8点36分5.2.1EB病毒转化技术Steinitz(1977）首先报道利用EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞，建立了能分泌半抗原抗体的人B淋巴细胞系。EB病毒（epstein-barrvirus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。

5.2人源性单克隆抗体制备本文档共114页；当前第104页；编辑于星期三\8点36分1.EBv特征含双链DNA，基因大小为170kb,含各不相同的重复序列。EB病毒仅能在B