狂犬病实验室检测技术

一、实验室操作前的要求及准备二、实验室检测方法本文档共42页；当前第1页；编辑于星期二\17点18分1实验室操作前的要求及准备（一）实验室条件及生物安全操作要求（二）检测标本的要求（三）实验前准备本文档共42页；当前第2页；编辑于星期二\17点18分2（一）实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室

操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3实验室内进行(实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。3、P3实验室

对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有P3实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。本文档共42页；当前第3页；编辑于星期二\17点18分34、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套，作好技术上的准备。5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。本文档共42页；当前第4页；编辑于星期二\17点18分41、采集时间

（1）应尽量采集较新鲜的标本。（2）采集时无菌操作，避免标本污染2、标本保存（1）尽量低温保存（2）存放于无菌离心管中并进行编号。

3、标本类型（1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。（2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于病原学检测，其中以脑组织中的阳性率最高；血清和脑脊液可用于抗体的检测。（二）检测标本的要求本文档共42页；当前第5页；编辑于星期二\17点18分5（三）实验前准备1、实验室及仪器的准备（略）2、各种试剂及材料的准备（略）本文档共42页；当前第6页；编辑于星期二\17点18分6实验室检测方法（一）DFA法（二）巢式PCR法（三）其它检测方法（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法（五）美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法本文档共42页；当前第7页；编辑于星期二\17点18分7（一）DFA法（直接荧光抗体法）

——检测狂犬病毒抗原

免疫荧光技术Ab优点Ag(尤其是不产生细胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特异性较高本文档共42页；当前第8页；编辑于星期二\17点18分8荧光抗体的染色方法可分为两类：直接法—荧光抗体直接与标本内的抗原反应,优点简便、快捷、有效减少非特异性染色,只适用于检测细胞内的抗原；间接法

—荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多

DFA原理：

抗体蛋白分子

++抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原

荧光素本文档共42页；当前第9页；编辑于星期二\17点18分9操作：1、材料和仪器2、操作步骤i.印片：

用酒精浸泡载玻片30分钟后取出、吹干，分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上；

ii.固定：

吹干后，取冷丙酮（4℃）室温固定7～10分钟；取出吹干，进行步骤3，或置于－70℃冰箱保存；

iii.加荧光抗体：

将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上（如果从冰箱中取出，则待雾气散掉后再进行此步骤。）；

本文档共42页；当前第10页；编辑于星期二\17点18分10iv.孵育：

将抗原片放在湿盒中，37℃温育30分钟；v.洗片：

取出后，用缓流冲洗抗原片3～5秒，再用PBS振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，每次2分钟，吹干；

vi.封片镜检：

用90％甘油（PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。

搅拌器及染色缸

本文档共42页；当前第11页；编辑于星期二\17点18分11结果判断：

仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、＋~＋＋＋＋－：无荧光；＋/－：极弱的可疑荧光；无荧光“－”

本文档共42页；当前第12页；编辑于星期二\17点18分12＋：荧光较弱，但清晰可见；本文档共42页；当前第13页；编辑于星期二\17点18分13＋＋：荧光明亮，且多个视野均有分布；本文档共42页；当前第14页；编辑于星期二\17点18分14＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且范围广泛；荧光强度“＋＋＋”荧光强度“＋＋＋＋”本文档共42页；当前第15页；编辑于星期二\17点18分15本文档共42页；当前第16页；编辑于星期二\17点18分16（二）巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸

传统的PCR检测模式一般需要三个步骤：制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或RNA）提取扩增过程：采用PCR或RT-PCR技术对核酸进行变性、退火、延伸扩增；检测过程：通过电泳等方法对PCR产物进行检测。

SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph本文档共42页；当前第17页；编辑于星期二\17点18分17巢式PCR（nested－PCR）：巢式PCR的原理：

是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。

优点：

特异性、灵敏度均比常规PCR好。缺点：

比常规PCR易污染。本文档共42页；当前第18页；编辑于星期二\17点18分18巢式PCR方法的操作：

1、RNA提取：Trizol法

（1）以下步骤在P2生物安全柜中进行

取不同位置的少量脑组织（50-100mg）＋1000μlTrizol先加200μl（研磨均匀）然后加满至1000μl[液体（唾液、尿液等）取250μl＋750μlTrizolLS]↓-70℃过夜或颠倒Epp管30～40次以便充分混匀内容物，室温放置5分钟（此步完可-70℃保存1个月）

本文档共42页；当前第19页；编辑于星期二\17点18分19（2）以下步骤可在普通实验室进行

-70℃取出，室温融化→加200μl氯仿，快速颠倒Epp管数次（30秒），使其呈淡粉红色↓室温放置3min↓4℃离心，12000rpm，15min（其间标记新的离心管，每管中加600μl异丙醇）↓取离心后水相600μl，加入新的离心管中，轻柔混匀↓室温放置10min（－20℃放置30分钟效果更佳）↓4℃离心，12000rpm，10min↓

本文档共42页；当前第20页；编辑于星期二\17点18分20缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀↓加1ml75％乙醇（DEPCH2O新鲜配制）洗涤沉淀↓4℃离心12000rpm，10min↓缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟（加入75％乙醇至－70℃可长期贮存1～2年）↓脑组织的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2个EPP管分装)[液体（唾液、尿液等）的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接进行逆转录或－70℃贮存

本文档共42页；当前第21页；编辑于星期二\17点18分21注意事项：

1.操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无RNA酶2.一次提取核酸，样本数不要太多（10个左右）3.加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确，否则容易降低提取效率4.异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果5.加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破坏到所提核酸6.尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间，水溶的RNA一定要低温保存7.标本及时放回-20℃或-70℃

本文档共42页；当前第22页；编辑于星期二\17点18分222、逆转录合成cDNA1）pd(N)6稀释至0.2ug/ul2）水浴预热至65℃（其间标记反应管）3）33ulRNA液65℃水浴10min（其间准备冰盒或碎冰）4）冰浴2min，瞬时离心。5）将液体转移至试剂盒反应管中32ul，先不要混匀。6）再向反应管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特异引物各0.5ul，使总体积达到33ul，室温1min，混匀，瞬时离心。7）37℃水浴，60min8）-20℃或-70℃保存cDNA本文档共42页；当前第23页；编辑于星期二\17点18分233、巢式PCR：本文档共42页；当前第24页；编辑于星期二\17点18分24本文档共42页；当前第25页；编辑于星期二\17点18分25琼脂糖凝胶电泳

1．电泳槽中注入缓冲液TAE2．将做好的琼脂胶放入电泳槽（加样孔在负极方向）3．Marker加5ul，样品加10ul5．电压：100V6．时间：30min

照相：凝胶成像仪/紫外透射仪本文档共42页；当前第26页；编辑于星期二\17点18分26（三）其它检测方法1、ELISA——检测抗原：包被抗体：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；

封闭：用含0.3％牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；加待检标本：将采集到的标本研磨，用pH7.4PBS制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200μl/孔，37℃孵育1小时；洗板：洗板四次；加酶标抗体：后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时；洗板：同上；加底物：加入酶反应底物，室温作用30分钟；终止反应：加2MH2SO4终止反应；观察结果：肉眼观察或酶标仪测定结果。本文档共42页；当前第27页；编辑于星期二\17点18分272、荧光灶抑制试验——检测中和抗体

中和抗体：

为疫苗免疫力程度的评判指标中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护快速荧光灶抑制试验（RFFIT）：为WHO推荐的检测方法

制备细胞悬液(1×10cells/ml的BSR细胞悬液)

↓

稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株）

↓

中和血清和病毒(0.1ml血清和标准病毒稀释液0.1m1，37℃中和1.5小时)

↓

检测剩余病毒(每孔加入50µl制备好的细胞悬液，37℃、5%C02过夜培养)

↓

固定(弃掉培养液，PBS洗一次，丙酮固定)

↓

荧光抗体检测(干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃30分钟)

↓

观察结果(PBS洗3次，荧光显微镜观察结果)

↓

计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制≥50％的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度)

步骤本文档共42页；当前第28页；编辑于星期二\17点18分283、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒研磨标本→

制成悬液（用PBS或MEM，30％）→

离心（4℃2000r/min离心20m）→

取上清接种细胞（鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞）→

吸附（2h）→

加维持液→

孵育(37℃、5％C02、4～5天)→

鉴定B.乳小白鼠接种法——分离病毒研磨标本

→

制成悬液→

离心→取上清接种乳鼠脑内（1～2日龄）→饲养→观察发病情况(未发病的鼠保留至21天后作DFA检测)本文档共42页；当前第29页；编辑于星期二\17点18分294、ELISA——检测狂犬病毒抗体ELISA方法测定的是总抗体，不代表具有保护性的中和抗体水平其结果仅供参考。5、染色镜检——检测内基氏小体本文档共42页；当前第30页；编辑于星期二\17点18分30（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法1、DFA法——检测狂犬病毒抗原

意义：阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。2、ELISA——检测狂犬病毒抗原

意义：检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法——分离狂犬病毒

意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。本文档共42页；当前第31页；编辑于星期二\17点18分314、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸原理：狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成一条cDNA链（RT）,再进行PCR。检测步骤：

1）病毒RNA的提取2）逆转录合成cDNA3）PCR扩增4）电泳意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。本文档共42页；当前第32页；编辑于星期二\17点18分325、狂犬病特异性抗体检测狂犬病特异性抗体：

在自然感染情况下，狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流）→故不能形成病毒血症。

在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒）。

晚期，狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。

因此，通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，只在临床疾病的晚期出现。本文档共42页；当前第33页；编辑于星期二\17点18分33A.快速荧光灶抑制试验（RFFIT）——测定中和抗体意义：中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护B.ELISA——检测狂犬病毒抗体意义：

1）接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml，表明已获得一定的保护。2）未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml，且近期有4倍增高，可考虑狂犬病。

3）部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。本文档共42页；当前第34页；编辑于星期二\17点18分34（五）美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法

1、DFA——检测狂犬病毒抗原

当以下情况发生时，需要重复（证实性）检测:

1）包涵体颗粒典型，但视野不到10％，或视野大于10％，但