微生物培养技术演示文稿

微生物培养技术演示文稿本文档共50页；当前第1页；编辑于星期二\1点39分微生物非细胞生物：病毒原核生物：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）本文档共50页；当前第2页；编辑于星期二\1点39分菌落1、概念：

单个或少数微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。2、菌落是鉴定微生物的重要依据：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等。本文档共50页；当前第3页；编辑于星期二\1点39分细菌菌落细菌的菌落特征因种而异本文档共50页；当前第4页；编辑于星期二\1点39分如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构真菌：酵母菌和霉菌青霉本文档共50页；当前第5页；编辑于星期二\1点39分一、微生物的分离和纯培养（3项技术1个案例）（一）培养基配制技术（二）无菌技术（三）接种技术

案例：大肠杆菌的分离和纯培养

本文档共50页；当前第6页；编辑于星期二\1点39分（一）无菌技术1、概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；④实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行——酒精灯的火焰旁的局部高温使微生物难以生存本文档共50页；当前第7页；编辑于星期二\1点39分2、消毒（1）定义：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）本文档共50页；当前第8页；编辑于星期二\1点39分A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min，日常生活常用B、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，适用于不耐高温的液体，如牛奶。C、化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源D、射线消毒法，如紫外线（2）消毒的方法：本文档共50页；当前第9页；编辑于星期二\1点39分（1）定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。2、灭菌本文档共50页；当前第10页；编辑于星期二\1点39分（2）灭菌的方法：A、灼烧灭菌方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(温度最高)灼烧(迅速彻底)适用范围：接种环、接种针、金属用具(接种工具)；试管口或瓶口(在接种过程中易被污染的部位)本文档共50页；当前第11页；编辑于星期二\1点39分C、湿热灭菌方法：高压蒸汽灭菌P8适用于培养基的灭菌B、干热灭菌：方法：干热灭菌箱,160-170℃下加热1-2h。适用范围：吸管、培养皿(玻璃器皿)、金属用具(能耐高温的、需保持干燥的物品)本文档共50页；当前第12页；编辑于星期二\1点39分1、培养基定义：（课本第9页）2、营养构成：环境条件：pH、氧气、二氧化碳、渗透压等

（二）培养基配制技术基本营养成分：水、无机盐、碳源、氮源等特殊营养成分：维生素、生长因子等特殊的、能满足微生物不同需要的营养物质。本文档共50页；当前第13页；编辑于星期二\1点39分固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等半固体培养基可观察微生物的运动液体培养基常用于发酵工业。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。3.培养基的分类本文档共50页；当前第14页；编辑于星期二\1点39分固体培养基平板培养基（课本第9页）斜面培养基固体培养基中需加入凝固剂，如琼脂本文档共50页；当前第15页；编辑于星期二\1点39分半固体培养基无运动有运动半固体培养基中也需要加入凝固剂琼脂，但加入量少于固体培养基。本文档共50页；当前第16页；编辑于星期二\1点39分液体培养基表面生长均匀混浊生长沉淀生长本文档共50页；当前第17页；编辑于星期二\1点39分选择培养基（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基加入青霉素的培养基:抑制细菌和放线菌的生长，分离酵母菌、霉菌等真菌。

不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌定义（课本第18页）举例：加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌本文档共50页；当前第18页；编辑于星期二\1点39分鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。

例如：在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别大肠杆菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽。

(课本15页)本文档共50页；当前第19页；编辑于星期二\1点39分

用化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确，常用于分类、鉴定等合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。合成培养基:天然培养基：（3）按成分：合成培养基和天然培养基(P9用化学成分不明确的天然物质配成的，如血清、组织提取液等本文档共50页；当前第20页；编辑于星期二\1点39分称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称量时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。4.培养基的配制步骤（第10页）（1）.计算:根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）本文档共50页；当前第21页；编辑于星期二\1点39分（2）.溶化：①加水加热熔化牛肉膏

将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。②加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。（3）.调节pH（4）.分装、包扎（5）.灭菌（6）搁置斜面P11或倒平板P13本文档共50页；当前第22页；编辑于星期二\1点39分搁置斜面------斜面培养基(P11)待试管冷却至50℃左右，将试管口部枕在高约1cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然冷却，斜面长度不超过试管总长的1/2.本文档共50页；当前第23页；编辑于星期二\1点39分待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。倒平板------平板培养基(P13)①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。平板冷凝后倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，①既可以使培养基表面的水分更好地挥发，②又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

本文档共50页；当前第24页；编辑于星期二\1点39分倒平板技术本文档共50页；当前第25页；编辑于星期二\1点39分（三）接种技术1.定义:在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。3.平板培养基上接种方法平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法2.斜面培养基上接种方法目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种目的：用来培养、分离细菌等微生物本文档共50页；当前第26页；编辑于星期二\1点39分斜面培养基上接种方法准备接种接种环灭菌挑取菌种划线接种培养、观察点燃酒精灯、取斜面培养基、取菌种试管灼烧多次，迅速彻底地灭菌试管口通过火焰2-3次，杀灭试管口微生物试管口灭菌接种环冷却后挑取菌种不要将培养基的表面划破37℃下培养24h本文档共50页；当前第27页；编辑于星期二\1点39分平板培养基上接种方法1、平板划线法将混在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞。准备接种接种环灭菌划线接种培养、观察试管口灭菌挑取菌种本文档共50页；当前第28页；编辑于星期二\1点39分平板划线操作本文档共50页；当前第29页；编辑于星期二\1点39分⑵平板划线要点①在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的原因——A.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；B.每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。②在划线操作结束时，仍需灼烧接种环的原因——划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。③在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因——以免接种环温度太高，杀死菌种。④在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因——划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。本文档共50页；当前第30页；编辑于星期二\1点39分2、稀释涂布平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落,即为纯培养物。本文档共50页；当前第31页；编辑于星期二\1点39分系列稀释操作本文档共50页；当前第32页；编辑于星期二\1点39分70%的酒精涂布平板操作步骤取菌液滴加到培养基表面本文档共50页；当前第33页；编辑于星期二\1点39分1、微生物实验室培养的基本操作程序（1）器具的灭菌（2）培养基的配制（3）培养基的灭菌（4）倒平板（5）微生物接种（6）恒温箱中培养（7）菌种的保存（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养本文档共50页；当前第34页；编辑于星期二\1点39分（1）制备牛肉膏蛋白胨培养基2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤本文档共50页；当前第35页；编辑于星期二\1点39分（2)配制培养基：计算称量；熔化；调PH；分装；灭菌；倒平板（3）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。（4）培养：倒置，37℃恒温箱，12和24h。（5）纯化培养：倒置，37℃恒温箱，24h。（6）菌种保藏：临时、长期保存法。本文档共50页；当前第36页；编辑于星期二\1点39分菌种的保存

1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法-20℃冷冻箱保存本文档共50页；当前第37页；编辑于星期二\1点39分二、测定微生物的数量本文档共50页；当前第38页；编辑于星期二\1点39分（一）测定微生物数量的方法1.直接计数法最常用：显微镜直接计数法（方法、优点、缺点、适用条件）一、基础知识本文档共50页；当前第39页；编辑于星期二\1点39分2、间接计数法：最常用的是稀释平板计数法稀释平板法稀释涂布平板法稀释混合平板法本文档共50页；当前第40页；编辑于星期二\1点39分1、土壤取样、制备土壤悬液土壤中分解尿素的细菌的分离与计数2、配制选择性培养基：采用唯一氮源为尿素的培养基尿素琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基二、实践案例本文档共50页；当前第41页；编辑于星期二\1点39分本文档共50页；当前第42页；编辑于星期二\1点39分3、样品稀释细菌：一般选用104、105、106倍的稀释液进行培养放线菌：一般选用103、104、105倍的稀释液真菌：一般选用102、103、104倍的稀释液4、取样及平板接种（涂布平板或混合平板）本文档共50页；当前第43页；编辑于星期二\1点39分

在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红，就可以准确的鉴定该种细菌能够分解尿素。5、培养与观察：细菌：30～370C的温度下培养1～2d；放线菌：25～280C的温度下培养5～7d；霉菌：25～280C的温度下培养3～4d。本文档共50页；当前第44页；编辑于星期二\1点39分当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。每克样品中的菌数＝(C/V)×MC:代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V:代表涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释的倍数6、细菌计数本文档共50页；当前第45页；编辑于星期二\1点39分菌落数的选择：一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落乘以稀释的倍数；若有两个稀释倍的平均菌落数均在30～300之