高效液相色谱分析技术

高效液相色谱分析技术2023/6/26第一页，共四十页，编辑于2023年，星期六HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。ABCABC进样流动相流动相固定相流动相一.基本原理2023/6/26第二页，共四十页，编辑于2023年，星期六按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻2023/6/26第三页，共四十页，编辑于2023年，星期六分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。

固定相又分为两类：①一类是使用最多的微粒硅胶；②另一类是使用较少的高分子微球

;

优点是强度大、化学惰性、使用pH范围大

(pH=1～14)；

缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。2023/6/26第四页，共四十页，编辑于2023年，星期六微粒硅胶占所有柱填料的80％,它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。使用微粒硅胶注意事项：pH使用范围是2～7.5，若过碱（pH＞8），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（pH＜1），键合相的化学键会断裂。硅胶键合相的优点：①硅胶的强度大②化学稳定性好③微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制2023/6/26第五页，共四十页，编辑于2023年，星期六按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：⑴正相柱：填料为极性，官能团为－CN、－NH2等⑵反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。“C18”柱——“万能柱”填料

“C18”柱即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl简称ODS），为最常用的“万能柱”填料，可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。

2023/6/26第六页，共四十页，编辑于2023年，星期六流动相：1.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：

正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇2.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃

最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。2023/6/26第七页，共四十页，编辑于2023年，星期六流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大②化学性质稳定，不损坏柱子③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收④粘度低，流动性好⑤易于从其中回收样品⑥无毒或低毒，易于操作⑦易于制成高纯度，即色谱纯⑧废液易处理，不污染环境2023/6/26第八页，共四十页，编辑于2023年，星期六HPLC的组成Pump泵

Injector/Autosampler进样器/自动进样器

Column色谱柱

Detector检测器

DataSystem/Integrator数据系统/积分仪表Allofthesecomponentscanhaveproblemsandrequiretroubleshooting.

所有这些部件都可能出现故障而需要检修。二、HPLC故障诊断2023/6/26第九页，共四十页，编辑于2023年，星期六HPLC出现故障可以从多方面入手1.从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化2.从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形3.从数据结果中分析2023/6/26第十页，共四十页，编辑于2023年，星期六1.从压力变化判断（Pressure）压力无压力高压力低压力不稳定2023/6/26第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除面版灯不亮电源不通检查电源接头松脱拧紧接头泵头漏液接口太松拧紧泵头螺丝泵密封垫磨损更换密封垫泵不送溶剂泵头有气泡排气泡，溶剂需脱气使用的溶剂黏性太高换低黏性溶剂溶剂贮液器中过滤器脏清洗贮液瓶、过滤器，排空阀打开关闭排空阀控制器设定不正确设置正确流动相不够补足流动相1.1压力无2023/6/26第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除压力值高滤头污染清洗连接管路进样阀阻塞冲洗，必要时更换泵流速设定太高设定正确的流速流动相使用不恰当使用恰当的流动相缓冲结晶盐沉淀冲洗样品与流动相不互溶稀释或改变流动相柱温太低升高温度色谱柱性能下降换柱1.2压力高2023/6/26第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除压力值低泵流速设定太低设定正确的流速色谱柱选择不恰当更换恰当的色谱柱柱温过高降低柱温系统漏液检查漏液位置并维修流动相使用不当改变流动相1.3压力低2023/6/26第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期六1.4压力不稳定现象判断故障排除压力变化重现性好采用梯度洗脱所引起的压力是正常泵内有气泡溶剂脱气不适当排气泡，溶剂需脱气压力波动泵密封垫损坏更换密封垫溶剂混合器故障清洗或更换混合器漏液连接口太松拧紧接口管路损坏更换2023/6/26第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期六基线漂移、噪声峰形异常（前沿、拖尾、变宽、分叉、无峰、负峰、鬼峰）保留时间变化2.从色谱图的异常情况推测2023/6/26第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除基线漂移测定的波长选择有误流动相含有紫外吸收化合物导致基线漂移检测器污染清洗检测器溶剂贮槽污染清洗贮槽更换新流动相冲洗柱子前次分析的样品中有强保留的物质用强度合适的溶剂清洗色谱柱2.1基线漂移、噪声2023/6/26第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除无规则基线噪音系统不稳或未达到平衡延长平衡时间系统泄漏检查并进行维修流动相污染或分解清洗溶剂贮液瓶、过滤器、使用HPLC级试剂流动相混合不均维修或更换混合器柱污染、填料流失或阻塞冲洗柱或更换柱检测池被污染或系统内有气泡用甲醇或其他强极性的溶剂冲洗流通池检测器灯能量不足更换灯2.1基线漂移、噪声2023/6/26第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除规则基线噪音流动相、检测器或泵内有气泡流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内的空气室温不稳使用柱温箱、将系统置于恒温、空气对流小的环境泵入口管路松或阻塞检查泵入口管路在同一水平上有其他设备关掉仪器，检查干扰是否来自于外部流动相混合不完全使流动相混合均匀或使用低黏度的溶剂2.1基线漂移、噪声2023/6/26第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.1峰前沿现象判断故障排除峰前沿柱性能下降更换色谱柱保护柱失效换柱芯进样体积太大或样品浓度太高降低进样体积或稀释样品浓度2023/6/26第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.2峰拖尾现象判断故障排除峰拖尾定量环与阀连接处出现死区更换定量环进样量太大减少进样量色谱柱或保护柱被污染清洗，必要时更换色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用选择恰当的色谱柱样品在流动相中溶解度小选择恰当的流动相2023/6/26第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.3峰展宽现象判断故障排除峰展宽进样体积或浓度过大减小进样体积、稀释样品流动相流速太低调节流速柱、流动相选择不当选择恰当的色谱柱或流动相缓冲液浓度太低增加浓度漏夜检查漏夜的位置并维修出现两个或多个未被完全分离的物质的峰选择其它色谱条件以改善分离效果检测器时间常数太大使用较小的时间常数2023/6/26第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.4峰分叉现象判断故障排除峰分叉柱性能下降更换色普柱保护柱失效换柱芯色谱柱或保护柱被污染清洗，必要时更换进样体积太大或样品浓度太高降低进样体积或降低样品浓度样品不稳定有部分分解防止试样组分的分解样品溶剂不溶于流动相改变溶剂或采用流动相溶解样品2023/6/26第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.5无峰现象判断故障排除无峰检测器选择或参数设置不当，样品无吸收正确选择检测器，如样品无紫外吸收就不应选UV检测器样品降解检查样品配制过程进样器故障，如注射器泄漏，定量环堵塞检查进样器样品浓度太低，而检测灵敏度不高适当提高样品浓度和进样量，并提高检测灵敏度检测器与数据处理装置连接故障检查并正确连接2023/6/26第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期六2.2.6负峰现象判断故障排除出现所有负峰连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测器信号极性相反改变极性设置出现一个或几个负峰使用的流动相吸收高使用流动相稀释样品自动进样器注射进空气清洗自动进样器2023/6/26第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期六

2.2.7鬼峰现象判断故障排除色谱图出现鬼峰样品中未知物处理样品样品前处理时产生降解或混入杂质用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品前一次进样的洗脱物增加分析时间或梯度洗脱、提高流速、两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱流动相中含有稳定剂或稳定剂变化使用无防腐溶剂注射器、六通阀、柱子、检测器或管路污染清洗2023/6/26第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除保留时间不重复系统不同或更换流动相时未达到平衡分析之前应有足够的时间使系统平衡溶剂配比不合适调节溶剂配比流速变化重新设定流速,检查泵是否正常工作室温波动大使用柱温箱柱被污染冲洗柱或更换柱2.3保留时间变化2023/6/26第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期六3.从数据结果中分析3.1定量结果现象判断故障排除精密度降低样品预处理时样品降解或混入杂质用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品保留时间改变，峰形不正常见“峰形不正常”的故障排除方法检测器响应故障检查检测器2023/6/26第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除精密度降低峰积分不正确重新设置参数进样问题（对外标法）（1）如使用注射器的手动进样器，需确保进样操作的重复性（2）如使用自动进样器需确保正确的进样体积，注射器不含空气，样品瓶有足够的样品，系统不泄漏准确度降低样品蒸发样品密封保存在适当的温度下样品前处理不当检查样品的处理过程内标物配置不当配置新的内标物3.1定量结果2023/6/26第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期六现象判断故障排除峰不能分辨改变保留时间见“保留时间改变”的故障排除数据处理装置的参数不正确适当输入参数，进标准样，提高准确度无峰改变保留时间故障排除方法数据处理装置的参数不正确重新适当输入参数，进标准样，提高准确度鬼峰见“鬼峰”可能的原因见“鬼峰”的故障排除方法3.2定性结果2023/6/26第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期六温度：10～30℃；

相对湿度<80％；

最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。三、HPLC的日常维护与保养HPLC的日常操作条件：2023/6/26第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期六六通阀进样器的使用及保养泵的保养柱的保养紫外灯的保养HPLC的日常维护与保养2023/6/26第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期六工作原理

手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。六通阀进样器的使用及保养2023/6/26第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期六手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％并且要求每次进样体积准确、相同；完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。六通阀进样器的使用及保养2023/6/26第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期六样品必须过滤，样品溶液均要用0.45(0.22)μm的滤膜过滤,防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。进样结束冲洗进样器：通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐