三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性详解演示文稿

三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性详解演示文稿本文档共35页；当前第1页；编辑于星期一\22点38分（优选）三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性本文档共35页；当前第2页；编辑于星期一\22点38分IF=2.77本文档共35页；当前第3页；编辑于星期一\22点38分这项研究考察了三种不同的拭子技术诊断识别慢性伤口感染的有效性。慢性伤口同时用伤口渗液，Z-技术和Levine-技术获得拭子样品，并同时进行伤口组织活检的取样。拭子和组织标本，采用定量及定性的实验室程序培养。伤口感染被定义为那些含有每克组织的1×106个或更多个微生物。精度是通过利用受试者工作特征曲线的组织标本中培养相关联的拭子标本的定量培养确定。83受试对象中，30例（36％）感染。在获得拭子标本中精度最高的是使用Levine的技术为0.80。根据Levine的技术，临界阈值设置为每拭子37,000个微生物，具有90％的敏感性和57％的特异性。使用Levine的技术和组织标本得到拭子标本之间的平均符合率为78％。调查结果显示，使用Levine-技术收集拭子标本提供合理准确的测量伤口的生物负荷，因为他们比组织培养更广泛的应用。Levine-技术的诊断有效性需要使用另一种参考标准，进一步研究，如感染相关并发症的发展。三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性

摘要本文档共35页；当前第4页；编辑于星期一\22点38分虽然通常使用拭子采集检查慢性伤口的生物负荷，但基于这些样品进行培养而得到的信息的有用性尚不清楚。此外，医疗保健提供者收集的拭子标本与“金标准”并不完全一致。本研究的目的在探讨三种不同的拭子技术诊断识别慢性伤口感染的有效性。该被解决的首要研究问题如下：感染和未感染，非缺血性，慢性伤口样本中基于伤口液的拭子标本的定量培养的准确性与组织活检（参考标准）的定量培养相比如何？使用Z-技术的拭子标本的定量培养与参考标准相比较精确度如何？使用使用Levine-技术的拭子标本的定量培养与参考标准相比较精确度如何？这三个拭子技术，定量培养的准确性有没有差异？用伤口液，Z-技术和Levine-技术获得的拭子标本的定性培养与组织活检定性培养之间的一致性如何？三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性

本文档共35页；当前第5页；编辑于星期一\22点38分以往研究【1-5】表明，拭子培养也许可媲美组织培养在确定慢性伤口的生物负荷。然而，由于设计和方法的问题，这些研究得出明确结论的能力一直是个问题。首先，各研究培养，分离和鉴定生物的程序变化很大。有些研究【1】漏报的实验室过程，使评估的严格性大打折扣。其次，一些研究的样本非常小【1,4】，而且有的是伤口模型【4】而不是临床病例。这些限制约束了推广。第三，大多数研究【3,5】没有提供一个“阳性”培养的定义或对任何生物的生长定义一个阳性的培养。因此，这不可能确定这些研究的结果是否与当前伤口微生物学的理解一致：即，所有继发伤口均被微生物污染，虽然它们不一定是感染。比较拭子与标准组织标本，它不与伤口感染的概念的合理定义相对应，妨碍得出关于诊断的有效性结论的能力。或许由这些研究中最严重的方法性问题是，用于收集拭子样品的特定技术没有被描述.【2,4,5】。由于伤口的准备（例如，清理或不清理），采样的区域，和采样的持续时间的不一致，拭子技术也大不相同。鉴于这种不同，对研究旨在检验拭子培养的诊断有效性的结果中，使用的具体技术可能是无法识别的混杂因素，虽然有显著性。三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性

摘要本文档共35页；当前第6页；编辑于星期一\22点38分本研究针对以往研究的局限性对研究和比较的拭子方法进行了充分说明和描述，对比拭子技术与标准标本采集方法（即“可行的”伤口组织活检），应用标准的，以研究为基础的阳性培养定义，采用和描述微生物学程序，以加强与定义相符的微生物的定量，并使用与满足诊断的有效性兼容的数据分析策略。虽然该示例只限于慢性伤口，本研究的结果适用于所有关于伤口愈合的二次研究，因为诊断的准确性不应该受病因的影响。本研究的第二个目的是检查认为是慢性伤口感染的危险因素的患者和伤口变量。这些因素和感染状况之间的关联，如伤口组织培养定量测量，将支持今后的研究。三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性

摘要本文档共35页；当前第7页；编辑于星期一\22点38分本次调查为一项观察性的，横断面研究设计。同时利用伤口液，Z-技术和Levine-技术从慢性伤口中获得拭子标本。每种技术诊断的有效性由各拭子技术标本的定量培养结果与组织活检的定量结果的关系来确定。此外，为了更完全描述每个拭子技术的性能，比较每个拭子技术的定性培养结果与组织标本定性培养结果的一致性。该序列与样品采集的时间被设计为使的变动在最小化范围内，培养结果与取标本前的伤口床操作和连续时间相关。三种拭子技术鉴定慢性伤口感染诊断的有效性材料和方法本文档共35页；当前第8页；编辑于星期一\22点38分研究对象包括病人非缺血性慢性创伤。对退伍军人事务医学中心部和一所大学相关的三级医院进行本研究。招收研究对象之前，研究方案先通过审查委员会批准。参加这项研究受试者的筛选和登记基于以下标准：年龄18岁或以上，全层慢性伤口，非缺血性慢性伤口，白细胞（WBC）计数大于1500个/mm3或淋巴细胞总数较大超过800个/mm3，血小板计数大于125,000/mm3，无凝血，且未接受抗凝治疗。伤口样本仅限于慢性伤口，以解决这项研究的第二个目的，即，研究慢性伤口感染与感染危险因素的关系。将样品限于非缺血性慢性伤口，以减少灌注不良的伤口因组织活检而引起感染的风险。样品被限制为全层慢性伤口，为了评价采集全层组织标本。低白细胞计数的患者被排除，减少因组织活检导致伤口感染的风险。患者的低血小板计数，凝血病，或抗凝治疗被排除，以减少因组织活检导致出血的风险。材料和方法设计、样本收集和研究变量本文档共35页；当前第9页；编辑于星期一\22点38分符合条件的受试者被列入研究，并由患者或法定代表人签署知情同意书。当一个患者有多个符合条件的伤口时，随机选择一个伤口。初步研究变量是伤口液拭子标本、Z-技术拭子标本、Levine-技术拭子标本，以及创面组织活检标本的培养结果。拭子和组织标本的处理和培养在一个专门的微生物研究实验室进行。材料和方法设计、样本收集和研究变量本文档共35页；当前第10页；编辑于星期一\22点38分用于培养组织样本的实验室方法与Krizek和Robson.【6】的方法类似。组织标本经过称重，匀化，并连续稀释在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB;Remel，Lenexa，KS）。每个稀释度接种于哥伦比亚血琼脂（Remel），BBL™CHROM-琼脂™念珠菌（BD，Sparks，MD），曙红亚甲基蓝琼脂（Remel），和减压琼脂培养基。减压琼脂平板放置在环境空气37℃的厌氧室中温育培养48小时。CHROM-琼脂™念珠菌板置于需氧腔室在30℃下进行最佳的酵母生长培养。所有其他培养板在5％CO2的通气条件下于37℃培养48小时，以利于链球菌属和其他需要复杂营养的生物体（苛养菌）的最佳生长。为提供定性的培养数据，微生物通过标准的方法鉴定，如菌落形态和革兰氏染色【7】.例如，金黄色葡萄球菌是通过对哥伦比亚血琼脂特征性的黄色B-溶血的菌落进行鉴定，呈现为革兰氏阳性球菌且表现出葡萄状簇，检验为过氧化氢酶试验阳性，金黄色葡萄球菌乳胶阳性。链球菌以兰斯菲尔德组（A，B，C，G和F）通过使用PathoDx试剂盒（Remel）适当的凝集抗血清进行鉴定。材料和方法组织样本的处理本文档共35页；当前第11页；编辑于星期一\22点38分为提供定量培养数据，每个所识别的微生物通过计数各板的菌落形成单位（CFU）进行定量。因为组织标本基于组织的重量，该平板计数乘以稀释因子，得到每克组织的微生物的数目。从组织标本的定量培养结果判定伤口的“真正”感染状态。伤口感染定义为每克活组织具有1×106以上的生物体【8】。类似地，未感染的伤口被定义为每克活组织小于1×106个生物体。尽管术语“大于105”被解释为是指每克组织的为1×105【9】和1×106【8】的生物体，但我们将1×106作为评价的临界值（MC罗布森，个人通信，2002年5月）。材料和方法组织样本的处理本文档共35页；当前第12页；编辑于星期一\22点38分不同于定量培养结果，从定性培养结果判定“真正”的感染状况，很少或根本没有证据来支持。也就是说，从伤口培养的结果中，目前还不清楚哪些微生物威胁到伤口，并最终构成感染【10】。由于慢性伤口通常是多种微生物生长，考虑到表面细菌的污染，伤口标本中难以辨别哪种细菌才是真正生长于伤口中的。在慢性伤口中生长的众多细菌种，专家认为，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，A，B组链球菌，厌氧菌是延迟愈合和引起感染的首要原因【10】，但几乎没有证据支持这一说法。目前还不清楚不同物种定植伤口的数目是否指示感染的状态。一些证据表明，多重微生物生长的慢性伤口有愈合不良结果.【11】尽管无法使用从组织标本中定性培养的结果来定义伤口的“真正”感染状态，而组织样品定性培养结果，可作为参考标准，用于检查各拭子技术获得拭子标本的性能，因为伤口活组织标本被认为是最有效的伤口标本。【12】材料和方法组织样本的处理本文档共35页；当前第13页；编辑于星期一\22点38分拭子标本置于1mL无菌盐水并离心15秒。然后将它们连续稀释于TSB（Remel），每个稀释度接种于哥伦比亚血琼脂（Remel），BBL™CHROM-琼脂™念珠菌（BD）和曙红亚甲基蓝琼脂（Remel）。CHROM-琼脂™念珠菌板置于需氧腔室在30℃下培养进行最佳的酵母生长。所有其他培养板在5％CO2的通气条件下于37℃培养48小时，以利于链球菌属和其他苛养菌的最佳生长。拭子样品未在厌氧条件下培养，因为拭子被认为是不适合用于厌氧培养.【7】独立的微生物用如上所述的方法进行鉴定以提供定性培养数据。通过计数每个平板上菌落形成单位的数量来定量每种微生物。因为稀释液基于一个拭子，平板计数乘以稀释倍数得到每拭子微生物的总数。材料和方法拭子标本的处理本文档共35页；当前第14页；编辑于星期一\22点38分次要研究变量（风险因素）作为研究过程的一部分，也进行了测定，以检查与慢性伤口感染的相关性。这些变量包括年龄，性别，种族，糖尿病，全身性抗生素治疗，红细胞数（RBC），白细胞，白蛋白水平，糖化血红蛋白（HbA1c）用于评估受试者的糖尿病水平，慢性伤口的类型，伤口的大小，伤口深度，溃疡渗液的研究，坏死组织的量，伤口组织氧含量（经皮血氧分压[TcPO2]测量），以及伤口敷料的类型。人口统计，医疗史，以及药物使用的数据（包括全身性抗生素）从病历和询问病人/照顾者得出。关于所研究的伤口的病史，类型和位置以及伤口敷料的类型数据都记录在案。血液样本送往实验室检测HbA1c水平，全血细胞计数和白蛋白水平。材料和方法数据处理本文档共35页；当前第15页；编辑于星期一\22点38分使用TcPO2检测仪（Novametric型号840Novametrix系统公司，沃灵福德，CT）测量伤口组织的氧含量。使用TcPO2检测仪无创的在邻近伤口的组织测量动脉血氧分压。TcPO2传感器固定在皮肤上研究伤口附近，大约检测20分钟再读取TcPO2值。在显示器上TcPO2水平稳定后再记录TcPO2值。TcPO2值在1分钟的时间内记录，间隔在5分钟。去除包扎后，Culturette®拭子（BD，科基斯维尔医师;样本1：伤口渗出液）在创面伤口渗出液明显处取样，并放置在一个带标签的容器中。伤口然后用无菌生理盐水清洗伤口。清洗之后，第二个Culturette®拭子紧密曲折地覆盖整个受伤部位的伤口表面，同时旋转拇指和食指之间的拭子（试样2：Z-技术）。然后将拭子放置在一个带标签的容器中。接着，以无菌生理盐水洗涤靠近伤口的中心区域的自由坏死组织和碎屑。第三个Culturette®拭子的末端旋转超过1平方厘米区，以足够的压力压5秒钟，从伤口组织提取液体（样品3：Levine-技术），并置于标记的运输容器。材料和方法数据处理本文档共35页；当前第16页；编辑于星期一\22点38分伤口组织活检（试样4：伤口组织），根据Stotts.【13】描述的步骤。清洁伤口后，用4-6毫米的真皮打孔工具，从伤口拭子取样的面积下取出伤口活组织（约1克）样品。在操作过程中保持严格无菌。将样品放置在一个带标签的容器中。拭子和组织标本运到微生物实验室进行定量和定性的培养。实验室技术人员不知道研究目的和研究方法，以尽量减少观察者偏倚。所有标本2小时采集的内，以尽量减少在相关的时间级数的生物体数改变处理。为所有标本标准化培养基和隔离标准，以减少在实验室方法的差异相关联的偏倚。不可擦除记号笔的在透明薄膜上标记伤口边缘轮廓。并标记上对应的识别号码和日期。伤口的深度是使用棉拭子放置在伤口的最深部分进行测量。拭子与伤口周围皮肤水平，在拭子上打点标记，并用厘米尺测量。直接观察伤口中床坏死组织的量并使用Likert-式量表定量伤口床覆盖坏死组织的百分率.【14】。用数码相机对伤口照相。材料和方法数据处理本文档共35页；当前第17页；编辑于星期一\22点38分将受试对象和伤口数据输入电子数据库，用范围限定和一致性检查清理数据。用创面组织标本的定量培养结果将伤口分类为感染或者非感染，使用前述感染的定义。此分类作为比较各拭子技术获得定量培养性能的参考标准。每种拭子技术获得的微生物类型和每个拭子微生物的数目的数据也被输入数据库。材料和方法统计分析受试对象和伤口的数据库被用来计算的主题和伤口样本的汇总统计，并计算用于检查被感染和未感染组间的差异推论统计。名义变量进行统计与百分比描述，并用卡方独立性检验或Fisher精确检验感染和未感染组间比较。连续变量的平均值和标准偏差进行了描述，并具有统计学使用非参数的Wilcoxon秩和检验被感染和未感染组之间进行比较。中位数也被描述为具有离群值连续变量。考虑到这些统计推断实验的探索性质，不对多重比较进行校正。双尾的α水平0.05被用来确定被感染和未感染组之间显著差异。汇总统计本文档共35页；当前第18页；编辑于星期一\22点38分为了解决研究问题1-3，使用受试者工作特征（ROC）曲线，非参数梯形法计算【15】来评价每个拭子技术的诊断正确性。这种方法非常适合于在这种情况，因为每拭子微生物的数量是一个连续的，而不是离散的变量。ROC曲线的灵敏度与特异性为预测变量的每个值的曲线，因此是显示的拭子技术的完整性能的图形化的方式。ROC曲线下面积（AUC）提供每个拭方法准确率总结衡量：它预测在区分感染和非感染伤口准确率.【15】据估计，随机选择病人的感染（伤口根据概率参考标准）将比随机选择患者的无感染伤口有一个更高的结果（每拭子生物的数量）。ROC曲线的AUC是在0和1之间。为是A无信息测试将有一个ROC曲线沿对角线在于，因而具有约0.5的AUC。甲非常丰富的测试将具有ROC曲线接近左上角​​和AUC接近1百分之九十五的置信区间（95％CI）分别计算每个拭子技术的AUC和零假设（H0：AUC=0.5）进行统计检验（α水平0.05，双尾）利用德隆，德隆描述的算法，和克拉克Pearson.16Computations用Stata®8.1适用于Windows（StataCorp，学院站，德克萨斯州）进行。材料和方法三个拭子技术精度本文档共35页；当前第19页；编辑于星期一\22点38分为了解决研究问题4，我们测试的三个AUC值的平等的全面零假设，如果全面零假设被拒绝，再进行两两比较。这些试验是用Delong等描述的算法【16】。所有测试均以双尾α=0.05为标准。为评估拭子技术的有用性，列表对应灵敏度水平的范围以估计特异性（即，0.90，0.80，0.70），以及相应的估计阈值和阳性和阴性预测值。对于一个给定的灵敏度，特异性估计通过从拟合ROC曲线的线性插值，而对应的阈值进行估计对应于最接近的较低和较高的观测特异性中的阈值的线性内插。对应的阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）通过灵敏度、估计的特异性估计并利用下面的关系伤口感染的样本中的样本的患病率：【17】材料和方法三个拭子技术精度的比较本文档共35页；当前第20页；编辑于星期一\22点38分其中p是样本患病率。每拭子1×106个生物体的阈值，还专门为了专门解决文献中报道的最常见的阈值检测。材料和方法三个拭子技术精度的比较本文档共35页；当前第21页；编辑于星期一\22点38分为了解决研究问题5，从组织标本定性培养与每个拭子技术的拭子标本进行定性的培养比较。首先，用定性培养结果描述组织标本和每个拭子技术。对每个伤口分离出不同物种的平均数进行计算，并计算该生物体，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，和A，B组链球菌的频率。从组织样本回收厌氧菌的频率也被制成表格。从拭子标本厌氧菌的复苏可能不会列，因为拭子标本在厌氧条件下不育。其次，对组织和拭子标本定性培养之间的一致性进行了检查。利用以下方程决定每个研究伤口在回收测定所有生物的一致性【2】：同时从组织和拭子样品分离的数目除以收集菌株的总数量回收，再乘以100。然后计算每个拭子技术的平均一致性。此外，在专门计算金组织和拭子标本之间黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，以及A，B组链球菌总数的一致性（即一致观察的总数/成对观测总数），阳性一致性（即，阳性一致性观察数/伤口组织或拭子标本培养中出现特定生物的总例数），以及阴性一致性（即阴性一致性观察数/伤口组织或拭子标本培养中未出现特定生物的总例数）。用以上三项措施计算一致性，是因为估计容易受一致的定义的影响，总一致性会被高比例的阴性一致率夸大，当阳性一致性很少发生时。材料和方法三个拭子技术的一致性本文档共35页；当前第22页；编辑于星期一\22点38分本研究对310名患者进行了筛选，根据排除标准，102名（33％）有合格。102名合格受试者中，83名（81％）同意接受研究登记，并参与完成了研究。拒绝参加的患者是因为他们反对从他们的伤口中取组织经行培养（N=19，符合条件者的19％）。被排除研究的208名患者中，大多数（N=136;65％的筛查患者）因为他们的伤口太表浅或太小而不适合全层穿刺活检。另57例患者（患者筛查的27％）因为病人有活检相关并发症的风险，如出血。83名患者参与了这项研究。68名（82％）为男性，而81名（98％）是白种人。结果本文档共35页；当前第23页；编辑于星期一\22点38分研究对象的人口学特征见表1，包括总数，感染组和非感染组。对感染组和非感染组比较，发现年龄，性别，种族，糖尿病状态，红细胞，白细胞和白蛋白水平没有显著差异。全身性抗生素治疗，与伤口的感染（Fisher确切概率P=0.011）有关。其中73例（88％）有1型或2型糖尿病，在被感染和未感染组之间HbA1c水平无显著差异。结果本文档共35页；当前第24页；编辑于星期一\22点38分伤口特征总结于表2，分总数、感染组和未感染组。83个伤口中的30例（36％）根据定量组织培养（样品4）定为感染。糖尿病足溃疡是伤口的最常见的类型。感染组和未感染组在伤口类型，伤口深度，伤口持续时间，坏死组织的量和伤口敷料的类型方面没有显著差异。结果本文档共35页；当前第25页；编辑于星期一\22点38分在感染组和非感染组（秩和P=0.009）之间的伤口大小有显著差异，未感染组具有较大的表面积（平方厘米）。进一步的分析显示，正在接受全身性抗生素的受试者伤口有较大的表面积。正在用全身抗生素治疗的伤口平均大小为14.5平方厘米（SD±22.99），而未进行全身抗生素治疗的伤口平均大小为8.8平方厘米（SD±21.87）;相应的中位数分别为7.9和2.00平方厘米。那些进行全身性抗生素治疗和未进行全身性抗生素治疗的伤口之间的大小有统计学差异（秩和p值=0.014），表明抗生素可能解释伤口大小和感染状态之间的关联。然而，在秩和分层分析（使用Cohran–Mantel–Haenszel统计），在全身应用抗生素控制后未感染的患者伤口大小仍高，显著性（CMHP=0.0255）。结果本文档共35页；当前第26页；编辑于星期一\22点38分三个拭子技术的ROC曲线绘于图1，且附有对角线参考。如图所示，Levine的技术（样品3）具有最大的AUC。此外，伤口渗液（样品1）和Z-技术（样品2）都在对角线参考线以上。结果三个拭子技术精度本文档共35页；当前第27页；编辑于星期一\22点38分表3给出了三个拭子技术的AUC和统计测试的结果来检查每个拭子技术的AUC是否显著大于0.5（即，对角参考）。所有拭子技术与诊断标准（伤口组织的定量培养）在一致性方面有统计学意义。结果三个拭子技术精度本文档共35页；当前第28页；编辑于星期一\22点38分如表3所示，Levine的技术（样品3）的AUC比其他两个拭子技术的AUC大得多。三个AUC值的零假设试验显著（χ2=6.15，P=0.0462），这意味着这三个组的AUC并不都是平等的。后续试验表明，Levine-技巧和Z-技术之间的差异有统计学意义（Z=2.13，P=0.0326），Levine-技术与伤口液之间有统计学差异（Z=1.94，P=0.0525）。表4列出了三种拭子技术一系列的灵敏度（即0.90，0.80，0.70），及相应的插值特殊性，临界阈值，阳性和阴性预测值。正如上述关于从ROC曲线和ROC曲线下面积的分析显示，对于给定的灵敏度Levine的技术具有最高的特异性。例如，Levine-技术，使用每拭3.7×104生物的临界值，有90％的敏感性和57％的特异性;相比较之下，对应于90％的灵敏度，伤口液和Z-技术分别具有40％和27％的特异性。表4还给出了对应于每拭子1×106个生物体的临界阈值的灵敏度和特异度具体情况。结果三个拭子技术精度的比较本文档共35页；当前第29页；编辑于星期一\22点38分结果三个拭子技术精度的比较本文档共35页；当前第30页；编辑于星期一\22点38分组织培养和拭子样品定性培养结果示于表5中。各种培养技术获得的细菌平均种数相类似，每个伤口从3.0到3.5种不等。在这些伤口样本中，金黄色葡萄球菌获得的频率比绿脓杆菌或A，B组链球菌都高。此外，各技术中获得的特定细菌的比例也相似。只在五个（6％）伤口中培养出厌氧菌。结果三种拭子技术定量的一致性本文档共35页；当前第31页；编辑于星期一\22点38分定量培养的一致性分析列于表6中。各拭子技术获得的所有生物的一致性值都较高。所有的一致性检测（即，总一致率，阳性一致率，阴性一致率）表明每个拭子技术在获得金黄色葡萄球菌方面高度一致。所有拭子技术在获得A，B组链球菌的阳性一致性最低，为67％。在一般情况下，对于Levine-技术在所有情况下的一致性值分别等于或大于伤口液和Z-技术，除了平均一致性更高。结果三种拭子技术定量的一致性本文档共35页；当前第32页；编辑于星期一\22点38分基于定量伤口组织培养，伤口的样本中36％是感染的。要注意，对于本研究中非常重要的是，感染专门定义为每克组织中1×106个微生物或更多，以避免术语“大于105”所引起的歧义。在比尔等【18】慢性伤口的研究中报道74