细胞培养技术与应用

第一节细胞培养与细胞工程概述第二节培养细胞的细胞生物学知识第三节细胞培养的基本条件第四节鱼类动物细胞培养技术第五节细胞培养技术的应用本章内容本文档共121页；当前第1页；编辑于星期日\22点21分第一节

细胞培养技术概述本文档共121页；当前第2页；编辑于星期日\22点21分瓶子中的细胞本文档共121页；当前第3页；编辑于星期日\22点21分细胞培养：将组织分散成单细胞，使其在类似于体内生存环境、适宜的体外条件下的生存、生长并维持其结构与功能的技术。培养过程中细胞不再形成组织。培养对象（培养物）是单个细胞（群）。本文档共121页；当前第4页；编辑于星期日\22点21分（1）概念类似、内涵相近（2）培养对象、培养物的差异（3）二者无严格的界限，可以相互转化辨别：细胞培养与组织培养的区别和联系？本文档共121页；当前第5页；编辑于星期日\22点21分动物细胞培养

植物细胞培养（1）技术的难度（2）专业的切合角度（3）关注热度和应用价值课程内容微生物细胞培养本文档共121页；当前第6页；编辑于星期日\22点21分①营养要求复杂、培养条件严格②培养的细胞容易发生变化③培养与真实的生存环境有差异①简化生长环境、方便控制因素②细胞群均一性好、大量、成本低③大规模生产生物制品细胞培养的利与弊本文档共121页；当前第7页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程细胞培养与细胞工程的关系本文档共121页；当前第8页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程细胞工程是现代生物技术各环节中承上启下的纽带。本文档共121页；当前第9页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程细胞培养技术是细胞工程的最基础、最核心的技术。本文档共121页；当前第10页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程用细胞生物学和分子生物学的理论方法，按照人们的设计，通过细胞水平上的操作，定向改造细胞或生物体、创造新种、加速繁育、获得产物。细胞培养细胞融合细胞器/核移植基因转移染色体操作本文档共121页；当前第11页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程通过人工培养获得细胞或细胞代谢产物本文档共121页；当前第12页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程获得具有新遗传特性或特定属性的产物、组织或生物体本文档共121页；当前第13页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程细胞工程是现代生物技术各环节中承上启下的纽带。核移植、细胞培养、细胞融合、胚胎发育综合应用克隆羊本文档共121页；当前第14页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程无限细胞系、细胞融合、细胞免疫的综合应用本文档共121页；当前第15页；编辑于星期日\22点21分细胞培养细胞工程染色体技术、细胞培养的综合应用多倍体育种本文档共121页；当前第16页；编辑于星期日\22点21分动物细胞培养的发展简史1907年：哈里森（Harrison），蛙胚神经组织，单玻片悬滴培养法创始人。1923年，卡雷尔（Carrel），卡氏瓶培养法，细胞组织生存空间的开拓者。1951年，厄尔（Eagle），体外培养动物细胞的人工合成培养基开发者。

波米拉（Pomerat），悬浮培养。1957年，杜尔贝科（Dulbecco），胰蛋白酶消化单层细胞培养法先行者。本文档共121页；当前第17页；编辑于星期日\22点21分动物细胞培养技术的应用动物育种生物制品生产生物基础研究临床医学本文档共121页；当前第18页；编辑于星期日\22点21分医学诊断与治疗（1）疾病诊断（2）细胞植入治疗羊膜穿刺术地中海贫血骨髓细胞本文档共121页；当前第19页；编辑于星期日\22点21分（3）药物效应检测动物筛选细胞筛选高效、经济、特异性检测有毒物质,把致癌、致畸形的物质加入培养液，对培养出的细胞进行染色体的检验,进而推断物质的毒性；本文档共121页；当前第20页；编辑于星期日\22点21分生物制品的生产梦想现实OR？？？本文档共121页；当前第21页；编辑于星期日\22点21分疫苗激素干扰素单克隆抗体这些都已经成为现实……动物细胞作为表达宿主，可生产蛋白质类的生物制品，病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体；本文档共121页；当前第22页；编辑于星期日\22点21分鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备鱼类细胞毒理学：评价样品对鱼类细胞的毒性等水产生物基础理论鱼类免疫学细胞培养在水产业中的应用本文档共121页；当前第23页；编辑于星期日\22点21分第二节

细胞培养的细胞生物学知识本文档共121页；当前第24页；编辑于星期日\22点21分细胞的发现本文档共121页；当前第25页；编辑于星期日\22点21分

英国科学家胡克（R.Hook,1635-1703),27岁成为英国皇家学会领导成员,发表对木栓的观察，命名Cell。荷兰人列文虎克（AntonivonLeeuwenhoek,1623-1723）用自磨镜片做成显微镜第一次观察了活的细菌和原生动物。本文档共121页；当前第26页；编辑于星期日\22点21分19世纪中期细胞学说建立施莱登施旺本文档共121页；当前第27页；编辑于星期日\22点21分19世纪中期细胞学说建立施莱登施旺细胞学说的要点：1、生物体都是由细胞构成；2、细胞由分裂产生新细胞；3、细胞是生物体结构和功能（生命活动）的基本单位。本文档共121页；当前第28页；编辑于星期日\22点21分非细胞结构:细胞结构：病毒：HIV、SARS、流感病毒、噬菌体等原核细胞：真核细胞：蓝藻细菌放线菌支原体衣原体立克次氏体所有动物除蓝藻外的植物真菌：如蘑菇、酵母菌、霉菌生物本文档共121页；当前第29页；编辑于星期日\22点21分原核细胞真核细胞原核细胞与真核细胞的本质差异本文档共121页；当前第30页；编辑于星期日\22点21分原核细胞真核细胞无以核膜为界限的细胞核有以核膜为界限的细胞核较小较大只有核糖体一种细胞器多种复杂的细胞器无染色体，有DNA分子有染色体（DNA和蛋白质构成）原核细胞与真核细胞的本质差异本文档共121页；当前第31页；编辑于星期日\22点21分圆球形、多面体形、纺锤形、长梭形、管状、长柱形、分枝状、不规则性。细胞的多样性本文档共121页；当前第32页；编辑于星期日\22点21分支原体巨型乌贼神经细胞蕨藻鸵鸟卵卵细胞本文档共121页；当前第33页；编辑于星期日\22点21分细胞质内质网核膜细胞核核仁线粒体高尔基体核糖体细胞膜溶酶体中心体叶绿体细胞壁液泡动、植物细胞的结构及区别本文档共121页；当前第34页；编辑于星期日\22点21分动物细胞与植物细胞的比较细胞器动物细胞植物细胞细胞壁无有叶绿体无有液泡无有溶酶体有无圆球体无有营养方式异养自养通讯连接方式间隙连接胞间连丝中心体有无胞质分裂方式收缩环细胞板本文档共121页；当前第35页；编辑于星期日\22点21分细胞的分裂一个母细胞经过一系列复杂的变化后，分裂成两个子细胞的过程，叫做细胞分裂。受精卵两个子细胞四个子细胞细胞团细胞分裂的意义？本文档共121页；当前第36页；编辑于星期日\22点21分单细胞生物个体数目增多细胞数目增多多细胞生物本文档共121页；当前第37页；编辑于星期日\22点21分2、细胞的生长与生长周期子细胞从周围吸收营养，合成自身的组成物质、不断地长大的过程。生长的结果？生长生长本文档共121页；当前第38页；编辑于星期日\22点21分3、细胞的分化本文档共121页；当前第39页；编辑于星期日\22点21分产生了各种不同形态、功能的细胞，它们构成了生物体的各种结构，以适应环境。细胞分化的结果：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构、生理功能上发生稳定差异的过程，叫细胞分化。本文档共121页；当前第40页；编辑于星期日\22点21分12345细胞分裂细胞分裂细胞分化细胞生长本文档共121页；当前第41页；编辑于星期日\22点21分细胞分裂、生长、分化的结果分裂：使细胞数目增多生长：使细胞体积增大分化：使细胞种类增多本文档共121页；当前第42页；编辑于星期日\22点21分细胞有寿命吗?细胞能无限制的分裂吗?本文档共121页；当前第43页；编辑于星期日\22点21分细胞的衰老、死亡本文档共121页；当前第44页；编辑于星期日\22点21分细胞的衰老：一般指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。本文档共121页；当前第45页；编辑于星期日\22点21分形态：细胞水分减少导致细胞萎缩，体积变小。结构：核增大，色素积累，染色质固缩。功能：新陈代谢速度减慢，呼吸速度减慢（线粒体功能退化、形变）有些酶的活性降低（酪氨酸酶）细胞膜通透性功能改变。衰老细胞的主要特征本文档共121页；当前第46页；编辑于星期日\22点21分细胞死亡自动死亡被动死亡(细胞凋亡)(细胞坏死)遗传物质控制外界因素最主要的一种方式，受Bcl-2家族、caspase家族等基因控制的主动的生理性细胞自杀行为。本文档共121页；当前第47页；编辑于星期日\22点21分凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。凋亡小体形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。细胞凋亡过程本文档共121页；当前第48页；编辑于星期日\22点21分动物个体内不同类型和寿命的细胞接近于动物的整体寿命的细胞，如神经元和肌肉细胞等。在胚胎发育终了时，这些细胞不再增加数量，在个体的生长期中它们可增长细胞体积，以使其与躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老，或者由于这些细胞的衰老、死亡引起个体死亡。缓慢更新的细胞，它们的寿命短于动物的平均寿命，如肝细胞，胃壁细胞等。快速更新的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。本文档共121页；当前第49页；编辑于星期日\22点21分Hayflick界限细胞（至少是培养的细胞），不是不死的、而是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。LeonardHayflick(1928~)正在检查他培养的WI-38细胞本文档共121页；当前第50页；编辑于星期日\22点21分体外培养细胞增殖与个体寿命的关系物种成纤维细胞传代数个体最长寿命（年）龟90-125175水貂30-3410鸡15-3530小鼠14-283.5人

胚胎40-60110

出生至15岁20-40

15岁以上10-30

早老病患者2-1010-20本文档共121页；当前第51页；编辑于星期日\22点21分细胞的无限增殖与癌变癌Cancer基因控制无限增殖衰老死亡×本文档共121页；当前第52页；编辑于星期日\22点21分梅艳芳宫颈癌马三立膀胱癌文兴宇肺癌罗京淋巴癌陈晓旭乳腺癌本文档共121页；当前第53页；编辑于星期日\22点21分肿瘤细胞正常细胞为什么会转化成癌细胞？癌细胞正常细胞原癌基因抑癌基因突变突变癌基因失去抑制作用不能控制（致癌因子的作用）不受控制，恶性增殖原癌基因抑癌基因癌基因本文档共121页；当前第54页；编辑于星期日\22点21分（1）物理致癌因子：辐射（紫外线、X射线、电离辐射等）致癌的外界因素本文档共121页；当前第55页；编辑于星期日\22点21分（2）化学致癌因子：无机物—如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等；有机物—如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等（3）病毒致癌因子：感染人的细胞，将其基因整合进入人的基因组，诱发癌变如：感染乙肝病毒可诱发肝癌；

感染人乳头状病毒可诱发宫颈癌；EB病毒是一种疱疹病毒，使儿童患淋巴癌、成人患鼻咽癌。本文档共121页；当前第56页；编辑于星期日\22点21分如何预防癌症？本文档共121页；当前第57页；编辑于星期日\22点21分在多细胞生物中，每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，只要条件许可，细胞都可发育成完整的个体。细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。细胞的全能性本文档共121页；当前第58页；编辑于星期日\22点21分高度分化的植物体细胞具有全能性，离体植物细胞在一定营养的物质、激素和其他适宜的外界条件下，能表现其全能性。本文档共121页；当前第59页；编辑于星期日\22点21分高度分化的动物体细胞也具有全能性吗？？？？本文档共121页；当前第60页；编辑于星期日\22点21分诱导多功能干细胞（iPScell）创始人之一。2006年山中伸弥等科学家把4个转录因子通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞。这意味着未成熟的细胞能够发展成所有类型的细胞。2007年，他所在的研究团队通过对小鼠的实验，发现诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力，这一研究成果在全世界被广泛应用。山中伸弥京都大学IPS细胞研究所所长2012年，获得诺贝尔生理或医学奖本文档共121页；当前第61页；编辑于星期日\22点21分细胞全能性高低与细胞分化程度有关，分化程度越高，细胞全能性越低，全能性表达越困难。胚胎干细胞成体干细胞多能干细胞全能干细胞专能干细胞干细胞本文档共121页；当前第62页；编辑于星期日\22点21分动物细胞核的全能性本文档共121页；当前第63页；编辑于星期日\22点21分第三节

细胞培养的基本条件本文档共121页；当前第64页；编辑于星期日\22点21分细胞培养……是以第一流的技术为基础的，没有其它可接受的标准。高深的理论知识本身不能产生良好的培养。我相信有了实践……才能产生满意的结果。《动物组织培养》英国，华斯莱实操理论＞本文档共121页；当前第65页；编辑于星期日\22点21分动物细胞培养的难点1、营养要求复杂；2、动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感；3、适应环境能力差，对环境（pH、溶解氧、温度、剪切力）敏感；4、倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染。动物细胞培养的基本条件本文档共121页；当前第66页；编辑于星期日\22点21分（1）无菌条件无菌条件是细胞体外培养最基本的条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。本文档共121页；当前第67页；编辑于星期日\22点21分蒸汽灭菌过滤除菌化学灭菌辐射灭菌火焰灭菌多重保险、确保无污染抗生素本文档共121页；当前第68页；编辑于星期日\22点21分无菌室（十万级）无菌操作台（百级）着装视频资料本文档共121页；当前第69页；编辑于星期日\22点21分污染难100%避免及时确认污染采取必要措施看检本文档共121页；当前第70页；编辑于星期日\22点21分及时确认发生的微生物污染最常发生的是霉菌和细菌污染。霉菌污染易于发现，如培养液中长出了各种菌落，肉眼可见，不难确认细菌感染时，有的引起培养液混浊，镜下可见大量细菌，有的培养液无明显改变如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基里滴少量培养物，置37℃温箱培养数日，观察有无菌落形成，以验证是否污染。经常发生和难以发现的是支原体污染。PPLO体积小，只有0.25~1m大小，且无细胞壁。PPLO污染后的细胞仍然能生存，甚至无明显变化，有时导致培养细胞发生不同程度的病理改变。本文档共121页；当前第71页；编辑于星期日\22点21分（2）营养条件动物细胞培养对营养要求非常严格，除氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、核酸外，还需要血清。培养液是细胞营养的直接来源。本文档共121页；当前第72页；编辑于星期日\22点21分碳水化合物：提供碳骨架和能量氨基酸：12种基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和谷氨酰胺维生素：常用的有烟酰胺、叶酸、核黄素、维生素B12、泛酸、吡哆醇及维生素C，维持细胞生长生长因子：包括激素类物质和促生长因子，如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、血小板生长因子、内皮细胞生长因子、生长调节素等无机盐：钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等本文档共121页；当前第73页；编辑于星期日\22点21分血清成分：激素生长因子结合蛋白贴壁扩展因子微量元素如硒缺点：价格贵、质量不稳定本文档共121页；当前第74页；编辑于星期日\22点21分（3）理化条件温度pH渗透压气分压体外体内本文档共121页；当前第75页；编辑于星期日\22点21分①温度维持细胞旺盛生长须有恒定适宜的温度。细胞代谢强度与温度成正比，低温下会使细胞代谢速率降低。温度过高导致细胞死亡，这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。如人体细胞最适温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。恒温培养箱本文档共121页；当前第76页；编辑于星期日\22点21分鱼类是变温动物，耐温范围较广，因此鱼类细胞培养对温度的要求没有哺乳动物细胞培养那么严格。牙鲆鳃细胞系大西洋鳕前肾巨噬细胞对虾肌肉组织细胞草鱼细胞水生哺乳动物本文档共121页；当前第77页；编辑于星期日\22点21分2）pH值：动物细胞生长大多需要轻微碱性环境，最佳为7.2~7.４过酸（低于6）或过碱（高于7.6）可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。耐受性强耐受性差本文档共121页；当前第78页；编辑于星期日\22点21分本文档共121页；当前第79页；编辑于星期日\22点21分3）气体二氧化碳培养箱气体是细胞生长代谢的必需条件，主要包括氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环(TCA)，产生细胞生长增殖所需的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。二氧化碳主要具有调节pH的作用。供给的体积分数一般为5%。本文档共121页；当前第80页；编辑于星期日\22点21分4）渗透压用平衡盐溶液配制各种试剂、洗涤，主要含无机盐和葡萄糖。鱼类细胞可耐受的渗透压范围更广。某些海水鱼，需要添加1.5%的氯化钠调节渗透压。本文档共121页；当前第81页；编辑于星期日\22点21分海洋节肢动物细胞培养本文档共121页；当前第82页；编辑于星期日\22点21分（4）常用培养器培养板培养皿细胞反应器疫苗、激素生产培养瓶本文档共121页；当前第83页；编辑于星期日\22点21分第四节

原代培养与传代培养本文档共121页；当前第84页；编辑于星期日\22点21分一、培养细胞的生长类型和特征贴壁型细胞悬浮型细胞(非贴壁型)兼性贴壁细胞：种类较少成纤维细胞型上皮细胞型不规则多角形放射状梭形火焰形球形游走型、多形型密度高、适用大规模培养三大类本文档共121页；当前第85页；编辑于星期日\22点21分培养细胞的生长特点a)贴附生长b)接触抑制c)密度依赖性细胞贴壁是一个非常复杂的多因素相关过程，支持物表面的清洁程度、所带电荷以及培养基中的一些蛋白、激素、多肽类物质都会影响，血清促进细胞贴壁主要是糖蛋白起的作用。三大特点粘附是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式本文档共121页；当前第86页；编辑于星期日\22点21分粘附是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式含义：有两方面结果：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。本文档共121页；当前第87页；编辑于星期日\22点21分培养细胞的贴附、伸展1234本文档共121页；当前第88页；编辑于星期日\22点21分接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量增加，形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制本文档共121页；当前第89页；编辑于星期日\22点21分1.培养的细胞之间

仍有在形态和机能上的相互依存关系。在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止，细胞相互沟通生物信息的结果。2.培养的细胞和基质之间

对细胞外基质仍有依存性

本文档共121页；当前第90页；编辑于星期日\22点21分去分化(脱分化):

各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性

如:培养的成纤维细胞在适当刺激下，可分化为

其它结缔组织细胞和肌组织细胞，表现出类似未分化的间充质细胞的特性，‘返祖’。1.

去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态

如:高度分化的神经细胞和心肌细已经丧失的增生活性不可能恢复但已经具备的生物电活动特性不会完全失去

本文档共121页；当前第91页；编辑于星期日\22点21分2.再分化：可重新表现出分化特点如：

把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞、内皮细胞，但，这种能力会随着培养时间延长逐渐丧失。总之，体外培养,使细胞结构与功能上的“可塑性”增大本文档共121页；当前第92页；编辑于星期日\22点21分1、取材无菌器械锋利及时培养剔除无关成分营养丰富记录保存信息资料视频原代培养也称初代培养，是从供体取出组织或分离细胞接种培养后至第一次传代之前的细胞培养阶段。二、动物细胞的原代培养本文档共121页；当前第93页；编辑于星期日\22点21分选取原则：个体健壮、无病，无外伤，避免选用某些携带内源性病菌的鱼类。个体越年轻，其细胞一般保持较强的分裂能力，体外培养成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼体应该是细胞传代的很好材料。组织材料的来源水生无脊椎动物：主要包括甲壳类、贝类、海绵等。水生脊椎动物，主要是鱼类。本文档共121页；当前第94页；编辑于星期日\22点21分供培养的组织材料要经过严格的擦洗、消毒与多次冲洗。海洋动物的组织还需用75%酒精、稀高锰酸钾溶液或二氯化汞、双氯苯双胍己烷溶液等再处理，以杀灭海洋中一些弧菌类有机体。再用维持液反复冲掉多余消毒剂，这样处理既能杀死细菌又能维持细胞活性。组织材料的清洗消毒弧菌是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。如霍乱弧菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。目前弧菌有91种。主要鱼贝类致菌为：溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌等本文档共121页；当前第95页；编辑于星期日\22点21分细胞悬液的分离：组织材料的分离组织块的分离：机械分散法（多级筛网）剪切分离法酶消化法离心法血液、羊水、胸腔水、腹水胰蛋白酶胶原蛋白水解酶本文档共121页；当前第96页；编辑于星期日\22点21分2、培养方法常用，操作简便；成功率较高适合组织量少；生长较慢、耗时长注意事项：轻拿轻放，及时更换培养液将组织剪切成小块后，接种于培养瓶中培养。①组织块培养法本文档共121页；当前第97页；编辑于星期日\22点21分②消化培养法步骤繁琐、易污染、成本高；适用大量组织、耗时短、效率高；应用消化分散法将组织细胞间质（基质、纤维）除去，使细胞分散，然后接种培养。酶消化本文档共121页；当前第98页；编辑于星期日\22点21分酶消化法采用较为广泛的方法，适用于绝大多数组织，并且在贴壁细胞传代时也多用此种方法。经常采用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶等。利用消化法得到的细胞量大，均一性好，细胞贴壁后可迅速形成单层。要注意不同组织需不同的消化酶浓度以及消化时间，否则会因消化过度而对细胞产生损伤。胰酶-EDTA消化液能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散冷消化热消化本文档共121页；当前第99页；编辑于星期日\22点21分a、贴壁培养法b、悬浮培养法少数动物细胞属于悬浮生长型，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。传代时不需要再分散，此法细胞增殖快、产量高。多数细胞属于贴壁生长型，使分散的单细胞先贴附在瓶壁或支撑物上后，再进行培养的方法。最终在附着表面扩展成单层。有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制，细胞产量有限。本文档共121页；当前第100页；编辑于星期日\22点21分

（1）组织块固定法当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块,按一定比例将组织块贴在瓶壁上,至少三十分钟以上,然后轻轻加人营养液置温箱培养。（2）机械分散法此法适用于细胞间连接较松散的组织,如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块,放入底部有一铜网的注射器内,用手的压力将组织挤出网孔,最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。（3）络合剂分散法目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸,它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散,经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。（4）酶消化法该法是目前采用极为广泛的方法,适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶,常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同,又可进一步分为冷消化法及热消化法。（5）冷消化法此法是将组织剪成约刀的小块,然后置一倍体积的胰酶中,四摄氏度培养。本文档共121页；当前第101页；编辑于星期日\22点21分草鱼肝脏组织细胞的原代培养：1．鱼体用0.01%高锰酸钾溶液浸泡消毒半小时。2．用70%酒精棉花擦洗解剖部位。3．剖开腹腔，取出0.5cm3的组织，除去粘膜和血块等，小烧杯中用小剪刀剪碎，用Hanks液洗3～4次。4．转入三角瓶，加0.25%胰酶20℃消化30分钟。5．消化完毕，加少许Hanks液，离心6．倒去消化液，用Hanks液重悬1~2次。7．用含有小牛血清的生长液重悬。8．计数，分装培养。实例视频资料本文档共121页；当前第102页；编辑于星期日\22点21分细胞由原培养瓶内分离稀释后，传到新的培养瓶进行培养的过程。进行一次分离再培养称之为传一代。需要进行传代培养的原因？初次传代的注意点：（1）充分生长；（2）消化时间的控制；（3）接种量大一些。细胞浓度应在200万个细胞/毫升以上，接种量太少不容易传代成功。三、动物细胞的传代培养本文档共121页；当前第103页；编辑于星期日\22点21分1悬浮细胞的传代直接传代：使悬浮细胞沉底，吸掉约2/3上清，悬浮细胞，然后分别接种两只或多只培养瓶。离心传代：将培养液于~1000rpm离心，弃去上清，加入新的生长液，吹打悬浮细胞，然后分别接种两只或多只培养瓶。本文档共121页；当前第104页；编辑于星期日\22点21分2贴壁细胞的传代确认细胞有无污染，吸出培养瓶内旧培养液；消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min,当见细胞间隙变大，细胞层出现麻布样网孔、细胞质回缩现象，即可终止消化。终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。接种培养。消化传代视频资料本文档共121页；当前第105页；编辑于星期日\22点21分1．待细胞长成单层后，倒去培养液，加胰酶-EDTA消化液，当单层细胞呈白色一片，而且细胞间出现针孔状空隙时，停止消化，再倒去消化液。2．加入细胞生长液，吹打分散3．分装培养，一般一瓶传二瓶，有的细胞株可以分装三瓶本文档共121页；当前第106页；编辑于星期日\22点21分培养细胞的生长增殖过程培养细胞的生命期一代贴附生长细胞的生长过程两个型曲线培养细胞的生命期本文档共121页；当前第107页；编辑于星期日\22点21分衰老死亡总细胞产量培养时间系列传代原代培养转化培养细胞的生命期细胞系连续细胞系移植培养123再培养间隔本文档共121页；当前第108页；编辑于星期日\22点21分衰退期细胞增生数时间停滞期指数生长期潜伏期增殖速率极限点细胞数极限点一代贴附生长细胞的生长过程培养动物细胞的不适应本文档共121页；当前第109页；编辑于星期日\22点21分游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟~4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂，机制：接触抑制、密度依赖性本文档共121页；