第五章目的基因的获取详解演示文稿

第五章目的基因的获取详解演示文稿本文档共73页；当前第1页；编辑于星期六\11点28分优选第五章目的基因的获取本文档共73页；当前第2页；编辑于星期六\11点28分已知基因的获取方法：⒈PCR技术扩增目的基因⒉化学方法人工合成目的基因本文档共73页；当前第3页；编辑于星期六\11点28分未知基因的获得途径：⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因2.构建cDNA文库，筛选目的基因3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因4.酵母双杂交体内鉴定基因本文档共73页；当前第4页；编辑于星期六\11点28分本章内容第一节基因组DNA的片断化

第二节基因的化学合成第三节目的基因的保存和扩增第四节目的基因的分离和扩增

本文档共73页；当前第5页；编辑于星期六\11点28分第一节基因组DNA的片断化二、限制性内切酶消化法一、

机械切割法本文档共73页；当前第6页；编辑于星期六\11点28分一.机械切割法（1）超声波断裂成约300bp的随机片断（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断（3）移液器抽吸法本文档共73页；当前第7页；编辑于星期六\11点28分二、限制性内切酶消化法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切基因组DNA本文档共73页；当前第8页；编辑于星期六\11点28分1.优点

如果带有粘性末端，产物可以直接与载体连接，连接效率高本文档共73页；当前第9页；编辑于星期六\11点28分2.缺点①目的基因内部可能有内切酶的切点BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！本文档共73页；当前第10页；编辑于星期六\11点28分②消化的片断分子量太大或太小不符合载体容量，不能克隆解决的办法采用随机片断化制备DNA的克隆片断本文档共73页；当前第11页；编辑于星期六\11点28分3.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度限制性内切酶的选用原则本文档共73页；当前第12页；编辑于星期六\11点28分1）4bp的内切酶平均每4096（46）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每256（44）bp一个切点随机程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’本文档共73页；当前第13页；编辑于星期六\11点28分文库：是指一种全体的集合。通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。

克隆并不是为了保存，而是为了分离。

第三节目的基因的保存和扩增一、基因文库（genelibrary）1.基因文库本文档共73页；当前第14页；编辑于星期六\11点28分为什么要建基因文库？高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常难的，必须构建基因文库，利用文库筛选技术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行分析。本文档共73页；当前第15页；编辑于星期六\11点28分基因文库的分类基因组文库：提取染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列。cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列推导出来。本文档共73页；当前第16页；编辑于星期六\11点28分mRNA结构图DNA结构图本文档共73页；当前第17页；编辑于星期六\11点28分2.基因文库的构建载体的制备DNA的提取及片段化、cDNA的合成载体与插入片段的连接

重组DNA分子导入宿主菌转化细胞的筛选本文档共73页；当前第18页；编辑于星期六\11点28分将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中繁殖保存和扩增。二、基因组文库的构建1.基因组文库理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因本文档共73页；当前第19页；编辑于星期六\11点28分筛选目的基因本文档共73页；当前第20页；编辑于星期六\11点28分目前常用的载体2.载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb本文档共73页；当前第21页；编辑于星期六\11点28分（1）λ噬菌体载体最常用

插入型载体构建文库时，通常用限制性核酸内切酶切割位于λ噬菌体DNA非必需区的单一酶切位点，以供外源基因片段的插入，插入片段适宜长度约为9kb。

替代型载体构建文库时，需要将非必需区两边的臂进行分析纯化，才能用于连接，插入片段适宜长度约为9～22kb。本文档共73页；当前第22页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第23页；编辑于星期六\11点28分（2）黏粒载体不仅能克隆和增殖完整的真核基因，还可克隆和分析组成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。（3）YAC、BAC载体克隆大片断DNA的载体。可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划中，YAC被广泛地用于大规模基因组结构分析。本文档共73页；当前第24页；编辑于星期六\11点28分最早用于基因克隆的载体。只能容纳比质粒分子量更小的片段。不能用于核基因组文库。适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。（4）质粒载体本文档共73页；当前第25页；编辑于星期六\11点28分3.基因组文库构建的一般步骤（1）基因组DNA的提取关键:制备高分子质量的基因组DNA经典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去除分子质量杂质。在提取时必须尽可能地避免机械切割本文档共73页；当前第26页；编辑于星期六\11点28分关键：断点完全随机，片断长度合适于载体连接（2）DNA克隆片段的制备超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断②酶切法：本文档共73页；当前第27页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第28页；编辑于星期六\11点28分（3）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾②人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片断本文档共73页；当前第29页；编辑于星期六\11点28分各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾本文档共73页；当前第30页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第31页；编辑于星期六\11点28分4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：本文档共73页；当前第32页；编辑于星期六\11点28分例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105本文档共73页；当前第33页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第34页；编辑于星期六\11点28分5.基因组文库的扩增及保存（1）基因组文库的扩增①液体培养增殖法最简便混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80℃储存（加终浓度为25%的甘油）缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。本文档共73页；当前第35页；编辑于星期六\11点28分保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80℃保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。本文档共73页；当前第36页；编辑于星期六\11点28分384孔板本文档共73页；当前第37页；编辑于星期六\11点28分②影印滤膜培养法失真最小，最麻烦用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（-80℃）保存。③制备已包装的转导性裂解物适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。本文档共73页；当前第38页；编辑于星期六\11点28分（2）基因组文库的保存小包装，方便，避免反复冻融噬菌体一类的基因文库：密封，加入少许氯仿，在4℃冰箱内可较长时间地保存（6个月），低温冰箱可保存数年。本文档共73页；当前第39页；编辑于星期六\11点28分500kb50-300kb本文档共73页；当前第40页；编辑于星期六\11点28分100-300kb，浓缩产物浓度达到100ng/ul本文档共73页；当前第41页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第42页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第43页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第44页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第45页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第46页；编辑于星期六\11点28分三、cDNA文库的构建cDNA文库：是指某种生物体某一发育时期所转录的全部的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库具有组织细胞特异性，具有时效性。为什么要构建cDNA文库？真核生物的基因组DNA庞大且含有大量的重复序列，难以分离到目的基因片段。本文档共73页；当前第47页；编辑于星期六\11点28分1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物2.cDNA文库的特点（1）不含内含子序列（2）可以在细菌中直接表达（3）包含了所有编码蛋白质的基因（时效性）（4）比基因组DNA文库小得多，容易构建本文档共73页；当前第48页；编辑于星期六\11点28分3.构建cDNA文库的一般步骤本文档共73页；当前第49页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第50页；编辑于星期六\11点28分（1）mRNA的来源特点：多数基因的表达具有不同程度的组织特异性和发育阶段性。

选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。高丰度：当特定的mRNA在细胞总mRNA群体中所占比例达到50～90％时。低丰度：当上述比例小于0.5％时。本文档共73页；当前第51页；编辑于星期六\11点28分分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300个A组成的polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-5%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化纤维素柱层析法本文档共73页；当前第52页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第53页；编辑于星期六\11点28分③mRNA的长度哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于。本文档共73页；当前第54页；编辑于星期六\11点28分反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。a.OligodT引导合成法从3’-开始，无法到达5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－DNA杂交分子本文档共73页；当前第55页；编辑于星期六\11点28分mRNA本文档共73页；当前第56页；编辑于星期六\11点28分b.随机引物引导的cDNA合成法合成6～10个核苷酸长的寡核苷酸短片段，作为合成第一链cDNA的引物。随机引物可用于合成特长的mRNA分子5’mRNA3’本文档共73页；当前第57页；编辑于星期六\11点28分用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板RNaseH本文档共73页；当前第58页；编辑于星期六\11点28分剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成自我引导合成法本文档共73页；当前第59页；编辑于星期六\11点28分④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’本文档共73页；当前第60页；编辑于星期六\11点28分本文档共73页；当前第61页；编辑于星期六\11点28分这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH（置换合成法）小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA本文档共73页；当前第62页；编辑于星期六\11点28分mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物本文档共