第六章体外标记免疫分析详解

第六章体外标记免疫分析详解演示文稿本文档共64页；当前第1页；编辑于星期六\12点1分优选第六章体外标记免疫分析本文档共64页；当前第2页；编辑于星期六\12点1分体外标记在核医学中的地位体内诊断：脏器显像

功能测定诊断

体外诊断：放射分析临床核医学治疗：131I治疗甲亢核医学实验核医学：利用核技术探索生命现象的本质和物质变化规律本文档共64页；当前第3页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析

体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。本文档共64页；当前第4页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析概念：

是利用放射分析方法或其派生的相关非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析方法。本文档共64页；当前第5页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析特点：

利用抗原－抗体结合反应的特异性，加上各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等。本文档共64页；当前第6页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析鼻祖:

(Yalow,July19,1921–)

美国科学家Yalow和Berson。于1956年创建的放射免疫分析(RIA)，测定人血浆胰岛素获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。本文档共64页；当前第7页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析获奖:在1977年Yalow和Berson因创建了放射免疫分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝尔生物医学奖。本文档共64页；当前第8页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析贡献:

随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体非竞争性结合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学的发展。本文档共64页；当前第9页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析

发展:

电化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光标记免疫分析

时间分辨荧光免疫分析酶标记免疫分析

放射受体分析

免疫放射分析放射免疫分析本文档共64页；当前第10页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量非竞争放射结合分析：标记抗体，抗体过量分类本文档共64页；当前第11页；编辑于星期六\12点1分第一节体外标记免疫分析的基本原理本文档共64页；当前第12页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析基本原理:非竞争性(标记抗体)IRMA体外标记免疫分析竞争性(标记抗原)RIA本文档共64页；当前第13页；编辑于星期六\12点1分放射免疫分析（RIA）原理放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。本文档共64页；当前第14页；编辑于星期六\12点1分放射免疫分析（RIA）原理

Ag待测抗原+*Ag+Ab*AgAb+*Ag(标记抗原)(特异性抗体)(标记抗原抗体复合物)(游离的标记抗原)

AgAb+Ag

抗原抗体复合物放射免疫分析（RIA）原理标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。*Ag和Ag具有相同的与Ab结合的能力本文档共64页；当前第15页；编辑于星期六\12点1分RIA(竞争结合反应)原理示意图AgAg*AbCFAg*BFB/F１.*Ag:定量、足量２.Ab:限量、特异３.*Ag和Ag具有相同的免疫活性４.Ag+*Ag>Ab的有效结合位点５.*Ag和Ag通过竞争的方式与Ab结合，随着Ag增加，*Ag与Ab结合形成的*AgAb复合物的量减少本文档共64页；当前第16页；编辑于星期六\12点1分放射免疫分析（RIA）实验操作步骤：加样（Ag，*Ag，Ab)→混匀，温育（反应达到平衡）→分离→测量→数据处理，质量控制本文档共64页；当前第17页；编辑于星期六\12点1分测量测量复合物计数示意图：

光子(射线能)与闪烁体的作用↓闪烁体(光脉冲、光能)↓光电倍增管(电能)↓前置放大器(电脉冲)↓电子探测仪

（计数单位是探测器输出的电脉冲数，CPM或CPS）本文档共64页；当前第18页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第19页；编辑于星期六\12点1分RIA(竞争性结合)标准品剂量反应曲线依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量本文档共64页；当前第20页；编辑于星期六\12点1分免疫放射分析(IRMA)原理单位点：

Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*Ab抗原（待测）标记抗体抗原标记抗体复合物双位点：Ad-Ag+*AbAd-Ag-*Ab

固体抗体-抗原（待测）标记抗体固体抗体-抗原-标记抗体复合物本文档共64页；当前第21页；编辑于星期六\12点1分IRMA(非竟争结合)反应原理本文档共64页；当前第22页；编辑于星期六\12点1分IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线本文档共64页；当前第23页；编辑于星期六\12点1分RIA＆IRMA的区别方法RIAIRMA1.标记*Ag*Ab2.免疫反应式Ag+*Ag+Ab

*Ag-Ab+AgAg+*AbAg-*Ab+*Ab3.Ab限量过量4.竞争竞争非竞争5.测量复合物*Ag-AbAg-*Ab6.测量物计数值与标本含量呈反比呈正比7.标准曲线形态╲╱8.灵敏度较低高9.测量范围较窄较宽本文档共64页；当前第24页；编辑于星期六\12点1分第二节体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术本文档共64页；当前第25页；编辑于星期六\12点1分基本试剂和基本技术１.标准品、质控品２.特异性抗体３.示踪剂(标记品)４.分离技术本文档共64页；当前第26页；编辑于星期六\12点1分１.标准品(1)化学结构:应与待测物具有相同的化学结构(2)化学纯度：高度纯化(3)化学度量：准确(4)稳定性：不易变质、不易降解本文档共64页；当前第27页；编辑于星期六\12点1分２.特异性抗体(1)亲和力大(2)高滴度(3)特异性强(4)可长期保存本文档共64页；当前第28页；编辑于星期六\12点1分３.示踪剂（标记品）

（1）高比活度（2）生物活性与免疫活性与标记前一致（3）化学纯度>95%（4）稳定性好：标记品不易脱落本文档共64页；当前第29页；编辑于星期六\12点1分４.分离技术---要求(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开(2)非特异性结合率（NSB%）低，小于5%(3)分离的成分便于测量(4)分离效果不受外界环境影响(5)分离试剂操作简便、价廉易得本文档共64页；当前第30页；编辑于星期六\12点1分微孔滤膜法盐析法活性炭吸附法磁化颗粒法双抗体法固相分离法分离方法本文档共64页；当前第31页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第32页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第33页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第34页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第35页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第36页；编辑于星期六\12点1分本文档共64页；当前第37页；编辑于星期六\12点1分

第三节体外标记免疫分析的类型本文档共64页；当前第38页；编辑于星期六\12点1分体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析放射性核素标记免疫分析(RIA、IRMA)酶标记免疫分析发光标记免疫分析(化学发光标记免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析)时间分辩荧光免疫分析本文档共64页；当前第39页；编辑于星期六\12点1分放射性核素标记免疫分析概念：一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定超微量（10-9～10-15g）物质的新技术。本文档共64页；当前第40页；编辑于星期六\12点1分放射性核素标记免疫分析分类:竞争性(标记抗原,抗体限量)RIA非竞争性(标记抗体,抗体过量)IRMA放射性核素标记本文档共64页；当前第41页；编辑于星期六\12点1分放射性核素标记免疫分析

优缺点：

自1959年Yalow和Berson创建的放射免疫分析（RIA）具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术。虽然RIA仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素作为标记物，存在人为的因素影响较大、辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。本文档共64页；当前第42页；编辑于星期六\12点1分酶标记免疫分析（EIA）概念：是应用酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）产生特异性反应，根据酶对底物的显色反应而定量分析待测抗原或抗体含量。分类:均相EIA：酶增强免疫分析（EMIT）非均相EIA:酶联免疫吸附分析法（ELASA）本文档共64页；当前第43页；编辑于星期六\12点1分时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)概念：是应用镧系元素标记抗原或抗体，利用紫外线或激光使其发射荧光，结合波长和时间两种分辨技术的微量分析方法。常用镧系元素：铕、铽、钐、镝特点：分析范围宽灵敏度高专一度高稳定性强1234本文档共64页；当前第44页；编辑于星期六\12点1分发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析（CLIA）电化学发光免疫分析(ECLIA)化学发光酶免疫分析(CLEIA)分类本文档共64页；当前第45页；编辑于星期六\12点1分化学发光标记免疫分析（CLIA）

化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。本文档共64页；当前第46页；编辑于星期六\12点1分发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）本文档共64页；当前第47页；编辑于星期六\12点1分化学发光标记免疫分析（CLIA）概念：利用化学反应中释放大量自由能产生激发态中间体，当其退激到基态时，发射出光子，对这些光子量进行测量从而进行定量分析抗原含量。常用发光剂：鲁米诺类、吖啶酯类特点：灵敏度高特异性强重复性好测定范围宽1234本文档共64页；当前第48页；编辑于星期六\12点1分化学发光酶免疫分析(CLEIA)是将高特异性的酶标记免疫分析技术和具有高灵敏度的化学发光分析技术相结合的一种标记免疫分析方法。发光剂：金刚烷特点：标记结合稳定发光持续时间长有利于测定123本文档共64页；当前第49页；编辑于星期六\12点1分辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图

本文档共64页；当前第50页；编辑于星期六\12点1分电化学发光免疫分析(ECLIA)简介：是新一代标记免疫分析技术，与其它标记发光免疫分析的原理不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，采用更为理想的标记物，使用磁性分离及电激发等新技术，进一步推动了发光免疫分析的发展，是目前最先进的化学发光免疫测定系统。本文档共64页；当前第51页；编辑于星期六\12点1分电化学发光免疫分析(ECLIA)原理：以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），与待测标本中抗原（抗体）产生免疫反应形成复合物以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学发光和化学发光反应两个过程。

特点准确性好多元检测均相测量稳定性好灵敏度高本文档共64页；当前第52页；编辑于星期六\12点1分

在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗原(抗体)，在反应体系内待测标本与相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。本文档共64页；当前第53页；编辑于星期六\12点1分

[Ru(bpy)3]2+为标记物三联吡啶钌为水溶性、高稳定性的小分子，可以确保电化学发光的高稳定性，并且无噪音干扰。三联吡啶钌结构简单,分子量小，所以，易于标记到任何物质（如抗原、抗体、核酸，等）上，并且对原物质的生物活性及免疫活性影响小。TPA是ECL中的电子供体，氧化后生成的中间产物是形成激发态[Ru(bpy)3]2+化学能来源。电化学发光免疫分析(ECLIA)的标记物本文档共64页；当前第54页；编辑于星期六\12点1分电化学发光免疫(ECLIA)反应模式图本文档共64页；当前第55页；编辑于星期六\12点1分电化学发光免疫分析测定示意图本文档共64页；当前第56页；编辑于星期六\12点1分第四节体外标记免疫分析的质量控制本文档共64页；当前第57页；编辑于星期六\