第三章高效液相色谱

第三章高效液相色谱1第一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四高效液相色谱法一、高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件三、固定相和流动相四、主要分离类型五、影响分离的因素第二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四以液体作为流动相的色谱过程HPLC定义第三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四高效液相色谱法的特点高压

---150~350x105Pa高效---3万塔板/米高灵敏度---10-9~10-11g高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法第四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四

GCHPLC流动相惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物不同极性的液体（有一定亲和作用）温度较高一般室温分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物GC与HPLC比较第五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四（一）分配色谱（二）吸附色谱（三）离子交换色谱法（四）排阻色谱法高效液相色谱法的类型第六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四分配色谱液液分配色谱(LLPC)键合固定相分配色谱(LSPC)

分配色谱法(PartitionChromatography)液体固定相通过物理吸附固定于载体表面有机分子通过化学反应键合到载体表面第七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四分配色谱–分离原理不同组分在两相间分配系数不同第八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四固定相

---物理吸附（担体+固定液）全多孔型担体薄壳型微珠担体分配色谱固定相固定相

---化学键合R---极性基团疏水基团离子交换基团第九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四固定相的化学构造非键合相表面键合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN第十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：

由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（OctaDecyltrichloroSilane)第十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四正相分配色谱反相分配色谱固定相性质极性非极性键合基团

极性基团疏水基团流动相性质非极性极性出峰顺序极性小先出极性大先出第十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四吸附色谱法分离原理溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争第十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四吸附色谱固定相

以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。第十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四离子交换色谱固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。

各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。分离原理固定相分离对象离子或可离解的化合物（无机离子、氨基酸、蛋白质等）第十五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四分离原理根据样品分子尺寸大小分离

大分子不能进入多孔中，不被保留，随Vm流出中分子部分进入多孔中，一般保留小分子完全进入多孔中，长时间保留。排阻色谱法

(凝胶色谱法)第十六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四1.软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2.半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色谱）

排阻色谱固定相第十七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同碱基支链分离。应用第十八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四流动液贮存提供脱气输液泵进样系统分离系统检测系统控制与记录系统

高效液相色谱仪第十九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四日本岛津公司第二十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四美国Waters公司第二十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四（1）真空泵抽滤系统（2）低溶性惰性气体导入替换（3）超声脱气（4）在线脱气流动相脱气方法第二十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四输液系统高压输液泵：高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。

活塞泵注射泵气动泵第二十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四进样系统不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀第二十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四色谱柱色谱柱泵泵12进样

不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀进样系统第二十五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。第二十六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四检测器

用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器第二十七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。多波长光度计类似，光栅或棱镜分光A＝lg（I0/It)=εbc紫外-可见检测器第二十八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。

特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。第二十九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四荧光检测器结构示意图光源检测器滤光片检测室第三十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。第三十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四电化学检测器（以电导检测器为例）电导仪电极电极第三十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四标准样品法谱库

HPLC-FTIRHPLC-MS定性分析定量分析峰面积∝浓度或质量第三十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四小结四种色谱分离模式的分离机理及应用范围反相色谱的概念紫外可见检测器常用的固定相和流动相第三十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四高效液相色谱应用实例第三十五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四

柱后pH调节电导检测对有机酸具有高选择性和高灵敏度第三十六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四有机酸分析系统流程图2348756

9101

1、2泵3进样器4柱温箱5电导检测器6数据处理机7混合室8柱子9流动相10缓冲液第三十七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四分析条件分离条件

色谱柱：Shim-packSCR-102H(8mmI.D．×300mmL.)1个或2个分析柱连接

保护柱SCR-102H(6mmI.D.×50mmL.)流动相：5mMp-甲苯亚磺酸水溶液流量：0.8mL/min温度：40℃或45℃检测条件缓冲液：20mMBis-tris水溶液

含

5mMp-甲苯亚磺酸和100μＭEDTA流量：0.8mL/min检测器：电导检测器

polarity;+第三十八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四样品的分析实例食品啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等体液血清，尿等医药品肾的透析液，钙制剂等发酵微生物培养液，酸奶等环境工厂废水等第三十九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四有机酸标准品的色谱图1一个分析柱

1.磷酸

2.柠檬酸3.丙酮酸4.苹果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸第四十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四啤酒的色谱图

1.磷酸2.柠檬酸3.丙酮酸4.苹果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸10.碳酸前处理振荡除去碳酸气后，过滤10μＬ进样第四十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四清酒的色谱图

1.磷酸2.柠檬酸3.丙酮酸4.苹果酸5.琥珀酸6.乳酸7.乙酸8.焦谷氨酸前处理过滤后，进样10μＬmin.第四十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四葡萄酒的色谱图

1.磷酸

2.柠檬酸3.酒石酸4.苹果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸前处理用水稀释10倍后过滤进样量10μＬ

min.第四十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四

酱油的色谱图

1.磷酸

2.柠酸3.丙酮酸4.苹果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸前处理用水稀释10倍后过滤进样量10μＬ第四十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四血清的色谱图

1.磷酸2.柠檬酸3.丙酮酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸7.焦谷氨酸8.未知物前处理加高氯酸用离心法去沉淀物，取上清液5uL进样第四十五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四尿样的色谱图

1.磷酸2.柠檬酸3.乳酸4.甲酸5.未知物6.焦谷氨酸7未知物前处理过滤后，进样10μＬ第四十六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四酸奶的色谱图

1.磷酸

2.柠檬酸3.琥珀酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸前处理用水稀释10倍后过滤进样量10μＬ第四十七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四工厂废水的色谱图

1.甲酸2.乙酸3.丙酸4.碳酸5.丁酸6.戊酸前处理过滤后，进样10μＬ第四十八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四食品安全是所有国家的每个消费者关心的基本问题。残留农药和兽药是食品中主要的污染物世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更加严格的完善。在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的检测中非常苛刻的。食品安全与污染物

第四十九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四农产品 -谷物：大米等 -豆类：大豆、豌豆等。 -水果：橘柑，苹果，葡萄等。 -蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 -茶叶，种子，蜂蜜等。食品中残留检测

审查农药残留家畜及水产品 -牛肉，猪肉等 -鸡肉、鹌鹑等 -鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等 -虾，对虾审查兽药残留第五十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四全世界使用的农药超过700种：杀虫剂，除草剂，杀菌剂，脱叶剂，植物生长调节剂。残留：残存在农产品中的农药（降解缓慢）及其代谢物由以下原因所致：-使用更稳定的化学物质作农药。-农药的过度使用以及不合理使用。最大残留限量(MRL)：食品安全的指标，通常MRL≤0.01-0.05mg/kg(ppm)食品中的农药残留第五十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四农药的残留（1）有机氯化物：

硫丹、荚蟥醚、克菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄氏剂、六氯苯、七氯有机磷化物：

苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，敌敌畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，丰索磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马拉硫磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷，甲拌磷第五十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四氨基甲酸酯：

灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹拟除虫菊酯

氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯含氮化合物：

甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙环唑，联苯三唑醇，灭锈胺，灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，敌稗，二甲戊灵，氟乐灵，多效唑。农药的残留（2）第五十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四在过去几年中，相关法规已完成或修订，控制程度更加严格。在欧盟和美国已建立起完整的监测网络（参考实验室；参考材料及标准；计算机监视小组等）在样品净化，色谱分离和检测中使用改进的和新的分析技术及方法，如GC/MS和LC/MS，就会产生更灵敏，更准确和更可靠的结果。公众比以前更加关注食品安全。欧盟和美国现在的形势第五十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四

灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，克百威

(呋喃丹),速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹

氨基甲酸酯类农药第五十五页，共七十一页，编辑于2023年，星期四丁醛肟威草肟威呋喃丹CPMC残杀威（PHC，Arprocarb）苯噁威

二甲杀威（MPMC）乙硫甲威灭定威甲萘威（NAC）XMC苯氧丁威（BPMC）甲硫威（Mercaptodimethur）异丙威（MIPC）乙肟威甲氧威（MTMC）氨基甲酸酯类农药结构第五十六页，共七十一页，编辑于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法流程图

1、脱气装置10、反应试剂输液机构2、低压梯度装置11、混合装置3、流动相输液机构12、荧光检测器4、梯度混合器13、阻尼盘管5、自动进样器14、反应盘管6、柱温箱15、反应盘管7、分析柱M1，M2：流动相8、化学反应箱R1，R2：反应试剂液9、脱气装置第五十七页，共七十一页，编辑于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法

N-氨基甲酸甲酯类农药的基本化学结构式它们的化合物在碱的条件下加水分解生成甲胺。这里生成的甲胺与一级胺的荧化衍生化试剂O-苯二甲醛（OPA）反应，可进行较高灵敏度的荧光检测。第五十八页，共七十一页，编辑于2023年，星期四氨基甲酸酯前处理过程第五十九页，共七十一页，编辑于2023年，星期四8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图

1994年6月9日官报上登载的成分的分析例

第六十页，共七十一页，编辑于2023年，星期四16成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图第六十一页，共七十一页，编辑于2023年，星期四甲硫威及其代谢物甲硫威代谢物高灵敏度分析例

（例如在橘子汁中不得含50ppb以上）

甲硫威的检测限（S/N=3）为2ppb

第六十二页，共七十一页，编辑于2023年，星期四离子色谱离子色谱过渡金属分析系统CN-离子分析系统第六十三页，共七十一页，编辑于2023年，星期四氨基酸分析系统

第六十四页，共七十一页，编辑于2023年，星期四氨基酸分析系统

NH2

RCCOOH