种鸡禽白血病病毒细胞分离检测技术规程

种鸡禽白血病病毒细胞分离检测技术规程1范围本标准规定了种鸡禽白血病病毒细胞分离检测的技术内容和要求。本标准适用于种鸡禽白血病净化中血浆、精液和蛋清样品中禽白血病病毒的细胞分离检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T36873原种鸡群禽白血病净化检测规程GB/T26436禽白血病诊断技术NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法DB34/T1891活毒疫苗中禽白血病病毒污染检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1种鸡种鸡是繁育下一代仔鸡的种用鸡群。3.2禽白血病病毒（avianleukosisvirus，ALV）ALV属于反转录病毒科的ɑ反转录病毒属。ALV可分为A～J10个亚群，其中A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡的禽白血病相关，可诱发鸡不同组织的良性和恶性肿瘤。A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病为内源性病毒，其致病性很低或没有致病性。3.3鸡胚成纤维细胞系DF-1（chickenembryofibroblastcelllineDF-1）DF-1细胞系来源于10胚龄的ELL-0鸡胚的鸡成纤维细胞株，自发永生化，可作为ALV病毒增殖的载体细胞。4细胞培养4.1细胞常规培养DF-1细胞采用DMED高糖培养基培养，培养基含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。细胞置于温度37℃，含5%二氧化碳的培养箱中培养。4.2细胞的传代与保存4.2.1细胞传代DF-1细胞贴壁培养至占细胞贴壁面80%-90%时，取出细胞培养瓶（皿），采用D-Hank’s缓冲液清洗细胞面2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，在显微镜下观察细胞消化进程，待细胞皱缩、变圆，并有少量细胞漂浮时，倾去消化液，在培养瓶（皿）中加入含血清培养基，终止胰蛋白酶的消化。采用移液器轻轻吹打细胞贴壁面，使细胞悬浮、分散。将细胞按1:3-1:4的比例接种到新的细胞培养瓶（皿）中加入培养基进行培养。细胞保存将DF-1细胞按照4.2.1进行消化，将悬浮的细胞加入到10mL离心管中，1000r/min，离心5min，弃去离心上清液，加入细胞冻存液，轻轻吹打细胞沉淀，使细胞充分分散。细胞冻存液含有70%DMED培养基、20%胎牛血清和10%二甲基亚砜。将细胞分装于2mL细胞冻存管中，每管加入1mL。将冻存管放置于细胞程序冻存器中进行程序性降温，最后将冻存管置于液氮中保存。4.3接种细胞的准备将生长状态良好的DF-1细胞进行消化，细胞消化操作按4.2.1执行，将细胞浓度调整为1×105个细胞/mL，接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1mL。待细胞生长至占细胞贴壁面70%时，可进行样品的接种。5接种样品的准备5.1种鸡血浆样品的准备5.1.1种鸡血浆的采集用消毒酒精棉球对鸡翅下静脉部位进行消毒，使用1mL一次性注射器或真空采血管进行采血，使用5mg/mL肝素钠作为抗凝剂。使用1mL注射器时先吸入0.2mL肝素钠，采血至1mL，或使用含肝素钠抗凝剂的真空采血管采血1～2mL。5.1.2种鸡血浆的保存与处理采集的鸡抗凝血样品应保存在4℃环境下，采集的鸡血液样品应尽快处理并接种DF-1细胞，保存期限最长不超过6h，否则应重新采样。将鸡抗凝血样品转移至灭菌离心管中，2000r/min离心2min，备用。5.2种公鸡精液样品的准备5.2.1种公鸡精液的采集按照GB/T36873中的操作方法进行种公鸡精液的采集。5.2.2种公鸡精液样品的保存与处理采集的公鸡精液样品应保存在4℃环境下，应尽快处理并接种细胞，保存期限不超过6h。在灭菌的1.5mL的离心管中，加精液样品40uL，加入160uL精液稀释液，充分振荡混匀，在4℃条件下10000r/min离心5min，备用。精液稀释液为含有1ug/mL两性霉素、500U/mL青霉素和500ug/mL链霉素的PBS溶液。5.3鸡蛋清样品的准备5.3.1鸡蛋清样品的采集清洗和消毒鸡蛋表面，在无菌操作XX，用剪刀在鸡蛋的气室端开口，用灭菌移液器吸取100uL蛋清样品转移至灭菌离心管中暂存。5.3.2鸡蛋清样品的保存与处理采集的蛋清样品应保存在4℃环境下，应尽快处理并接种细胞，保存期限不超过6h。在100uL蛋清样品离心管中加入100uL灭菌PBS，充分混合后，备用。6样品接种细胞6.1鸡血浆样品的接种将5.1.2中处理后的血液样品用移液器吸头轻轻旋转上层血浆，使处于中层的白细胞悬浮与血浆中，吸取100uL血浆接种到DF-1细胞培养孔中，样品孔做好标记，并在每个细胞培养孔中加入40uL肝素钠溶液，防止血浆凝固。6.2公鸡精液样品的接种将5.2.2中处理后的精液样品按照GB/T36873中的方法进行种公鸡精液样品的接种，样品孔做好标记。6.3鸡蛋清样品的接种将5.3.2中处理后的蛋清样品，每个样品取100uL接种到DF-1细胞培养孔中，样品孔做好标记。7细胞接种后的维持培养及注意事项7.1细胞的维持培养将接种样品后的细胞板放入细胞培养箱继续孵育3h后，弃去细胞培养孔中液体，用200uL灭菌PBS润洗细胞孔1次，加入细胞维持培养液1mL，继续培养7～9天。细胞维持液培养液含99%DMED高糖培养基培养、1%胎牛血清、200U/ml青霉素和0.2mg/ml链霉素。7.2细胞维持培养的注意事项（1）每次检测应设立阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。阳性对照在细胞培养孔中加入阳性样品，阴性对照细胞培养孔中加入阴性样品，空白对照孔不加样品。（2）细胞维持培养期间应每天观察，在细胞状态允许的条件下应尽可能XX细胞维持培养的时间，以利于ALV在细胞上的增殖。（3）在24孔培养板靠边的样品孔中多加入0.3mL细胞维持培养液，以补偿靠边样品孔的水分蒸发。8细胞样品的检测8.1酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测ALVp27抗原从培养箱中取出培养7～9天的细胞培养板，反复冻融2次，取各细胞孔中的培养液作为检测样品进行ELISA检测，应按照NY/T680中的方法或采用符合NY/T680要求的商品化试剂盒检测细胞培养上清中ALVp27抗原。8.2间接免疫荧光抗体反应（IFA）方法检测ALV抗原从培养箱中取出培养7～9天的细胞培养板，采用灭菌PBS清洗细胞表面2次，尽量吸尽细胞孔内的液体，加入500uL4%多聚甲醛固定细胞30min，按照GB/T26436中的方法进行IFA方法检测。8.3PCR方法检测ALV核酸将维持培养结束后的细胞用灭菌PBS清洗细胞表面2次，加入100uL0.25%的胰酶消化液，消化5min，将细胞轻轻吹打悬浮后收集细胞于1.5mL离心管中，2000r/min离心5min，收集细胞沉淀。按照GB/T26436中的方法进行细胞DNA提取，按照DB34/T1891中的方法进行PCR方法检测。9检测结果判定9.1ELISA方法检测ALVp27抗原的结果判定检测结果按照NY/T680中的方法进行判定，如采用符合NY/T680要求的商品化试剂盒检测，检测样品的结果应根据试剂盒说明书判定。注：对于一些样品检测结果明显高于阴性对照孔（加入阴性对照的细胞培养孔）数值，但未达到ELISA方法判定的阳性标准时，如出于种鸡净化的目的想要淘汰可疑感染的种鸡，可通过人为设定阴性对照孔数值的倍数值（2～4倍）来作为种鸡淘汰的标准。9.2IFA方法检测ALV抗原的结果判定在荧光显微镜200倍或400倍放大条件下观察细胞，XX性对照呈现明显的亮绿色荧光，阴性对照和空白对照无亮绿色荧光时，检测结果成立。检测样品的结果按照GB/T26436中的方法进行判定。9.3PCR方法检测ALV核酸的结果判定检测样品的结果按照B34/T1891中的方法进行判定，并且XX性对照为阳性，阴性对照孔和空白为阴性时PCR检测结果成立，否则检测结果不成立。

附录A（规范性附录）试剂的配制A.1磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，PH7.4）氯化钠8g氯化钾0.2g磷酸二氢钾0.2g十二水磷酸氢二钠2.83g蒸馏水加至1000mL在温度121度、压力0.12MPa条件下灭菌15分钟。A.2D-Hank’s缓冲液氯化钠8g氯化钾0.9g磷酸二氢钾0.06g十二水磷酸氢二钠0.152g葡萄糖1g蒸馏水加至1000mL分装于200ml小瓶中，在温度121度、压力0.12MPa条件下灭菌15分钟，临用前用无菌的5.6%NaHCO3调pH至7.2～7.6。A.30.25%胰酶消化液D-Hank’s缓冲液100mL胰酶（粉末）0.25g0.5mol/L EDTA         1ML用1mol/LNaOH 调节pH 至7.2～7.4，用0.